Science子刊：将CRISPR-Cas9意料不到的基因改变影响降到最低

CRISpR-Cas9分子工具可用于治疗遗传性血液疾病，但这可能会导致意想不到的基因改变。MDC的研究人员Klaus Rajewsky和Van Trung Chu领导的一个小组现在在《科学进步》中提出了一种方法，可以将这种不良后果降到最低。

CRISpR-Cas9基因编辑工具的治疗潜力被寄予厚望。这些“分子剪刀”可以用来非常精确地切割和修复导致遗传疾病的基因突变。但是，尽管该工具能够精确地定位基因组中的目标，它的工作还不是完全没有错误。

有时，剪切位点与目标序列非常相似，但位于完全不同的DNA区域。这些错误被科学家称为“脱靶突变”，可能会产生意想不到的后果。即使CRISpR-Cas9在正确的位点进行切割，当切割被修复时也会发生错误——这种现象被称为“脱靶突变”。

把切口隔开

Helmholtz协会(MDC)柏林Max Delbrück分子医学中心免疫调节和癌症实验室主任Klaus Rajewsky教授解释说:“这些错误的发生主要是因为，在经典的方法中，DNA分子的两条链同时被切断。”这位科学家现在在《科学进展》杂志上提出了一种被称为“spacer-nick”的新改进方法。这种方法使用了一种改良的分子剪刀，被称为nickases，它在DNA的两个不同点上对相反的DNA链造成刻痕。

但是，这对基因编辑组合能够更精确地检测和修复有缺陷的基因，在很大程度上取决于该团队在工具中内置的一个间隔器。Rajewsky实验室的科学家、与Rajewsky本人共同撰写这篇论文的作者Van Trung Chu博士解释说:“我们使用这种间隔物来确保两个缺口相隔200到350个碱基对，从而避免DNA中的双链断裂。”“我们对造血干细胞和T细胞的实验表明，这是最大限度减少靶内和脱靶突变的最佳距离，”Chu说。“再短一点，我们就有可能剪断整个DNA分子——尽管使用了两把独立的剪刀。”

另外两个MDC团队——Kathrin de la Rosa教授的癌症与免疫学/免疫机制和人类抗体实验室，以及Ralf博士Kühn的基因组编辑与疾病模型实验室也对这篇论文做出了重要贡献，特别是在检测脱靶突变方面。Rajewsky说:“因此，Spacer-nick也是研究中心不同实验室的研究人员成功合作的一个很好的例子。”

有效，几乎没有错误

科学家们甚至可以量化他们的微调基因剪刀和抵消双缺陷的优势:“使用经典的CRISpR-Cas9方法，在40%以上的干预中发生目标突变，”Chu报告说。“Spacer-nick系统可以将这一比例降低到2%以下。”

无法轻易准确地确定脱靶突变是否成功,“我们只能说，当使用经典的基因剪刀时，脱靶突变发生得相对频繁，但在我们的方法中，这种情况即使不是不存在，也是罕见的。”目前尚不清楚的是遗传物质在间隔切口后修复的确切机制。“这似乎不是通过众所周知的,而且容易出错的NHEJ途径发生的，”Chu说。

就有效性而言，Spacer-nick与常规工具相当:“在这两种方法中，我们能够成功修复20%到50%的处理过的细胞，”Chu说。他解释说，这可能已经足够治愈那些患有遗传性血液疾病的病人了，这种疾病只源于一个被改变的基因。这类疾病的例子包括β地中海贫血，它涉及血红蛋白合成错误，或严重的先天性中性粒细胞减少症，其特征是粒细胞(一种白细胞)数量显著减少，与严重削弱的免疫防御有关。

干细胞修复

Chu和Rajewsky希望其他研究人员也能接受他们的想法，首先在动物模型上测试Spacer-nick，然后很快在第一批人类患者身上测试。Chu解释说，这种疗法背后的原理很简单:造血干细胞是用现有的方法从患有单基因遗传疾病的人身上提取的。然后，Spacer-nick在细胞培养中直接修复有缺陷的基因。一旦基因剪刀完成工作，修复后的干细胞就会被送回患者体内——在那里它们会产生新的，最重要的是，健康的血细胞。

precise CRISpR-Cas–mediated gene repair with minimal off-target and unintended on-target mutations in human hematopoietic stem cells