背景

为患有遗传疾病的个体建立治疗方法是生物医学研究中最具挑战性和最令人兴奋的前沿领域之一。在为这些疾病开发解决方案的努力中，最值得关注的就是基因疗法。

基因疗法是如何起作用的

基因疗法是通过将一段矫正性遗传物质直接插入受影响的组织细胞来治疗疾病。这种遗传物质可以弥补缺陷，纠正功能障碍，并可能赋予对抗感染甚至癌症的新能力。基因疗法可以在不使用药物或侵入性手术的情况下实现这一点。为了确保这一有前途的方法的成功，确认相关基因治疗的安全递送是至关重要的。生物工程病毒是这种方法的首选运载工具，腺相关病毒(AAV)具有巨大的前景。
The three phases of aav-based gene therapy research with HiFi sequencing图1。HiFi测序为基于aav的基因治疗开发提供帮助。

pacBio的科学家Elizabeth Tseng博士以及Homology Medicines Inc.的Don Selby和terance Hanscom博士一起讨论了HiFi测序技术无与伦比的准确性和灵活性如何在AVV基因治疗的每个发展阶段带来革命性的变化:从发现到设计和评估。

关键亮点:

HiFi读取的长度和准确性可以用来发现难以捉摸的新的AAV物种和菌株，更适合治疗设计的要求。

DNA碱基修饰检测和HiFi测序的准确性可用于确保载体包含预期的治疗序列。有了HiFi读取的力量，你可以捕捉以前看不见的错误，并查明基因治疗可能需要改进的领域。

用Iso-Seq方法获得的RNA全长亚型序列能帮助您评估潜在的治疗基因是否被引入宿主并将提供预期的治疗，如果不是可以提供需要了解哪些需要修改的详细信息。

用最先进的HiFi测序工具检测载体

利用HiFi读取的不可思议的长度和准确性，发现新的AAV株，以更适合您的治疗设计的要求。

在网络研讨会的第一部分，Elizabeth Tseng博士介绍了HiFi测序如何在发展的每个阶段潜在地改善AAV基因治疗的令人信服的概述。她概述了pacBio的循环一致测序(又名HiFi测序)工作流程，以及它如何能够多次读取整个约4.7kb的AAV基因组(包括ITR倒置末端重复区域和那些被竞争的短读长测序技术错过的高GC含量区域)，以创建更多细节和准确性的基因组组装。

AAV HiFi sequencing workflow
图2。AAV研究的HiFi测序工作流程概述。

这种难以置信的精确水平使研发团队有可能发现新的AAV株，可能比目前常见的更适合特定治疗目标的要求。这种来自HiFi测序的详细而准确的见解使基因治疗开发者有可能创造出针对其治疗可交付性定制的AAV传递载体。

体验一场由HiFi数据驱动的载体开发革命
帮助确保您的载体包含正确的治疗基因序列，捕捉以前不可见的错误，并通过预自由碱基修饰检测和HiFi测序惊人的准确性，查明您的基因治疗的结构区域是否可能需要改进。

在Tseng博士的演讲的基础上，Don Selby博士，一个分子生理学家，同时也是Homolog Medicines公司研究载体设计的首席科学家，概述了HiFi测序是如何帮助设计和修改正在开发中的AAV携带基因载荷的。他总结了HiFi测序的长度和准确性不仅有助于了解基因治疗的插入序列是否在开发过程中保持正确，而且HiFi的甲基化检测能力允许他的团队排除修改插入AAV载体后导致断裂的基因设计。“最终你所拥有的是一个更高效的设计过程，所以就我们提出(新的)载体和提高效率而言，(HiFi)是我们的游戏规则改变者。”研究小组首先将断裂基因的单链片段与全长、完整的互补链结合。然后，这个连接的DNA片段被甲基化的DNA碱基修复。然后将修复后的分子送去进行HiFi测序，并进行碱基修饰检测。测序过程中的HiFi读取显示了这些甲基化的DNA碱基以及它们在DNA分子中的确切位置。这使得研究人员能够确定他们的治疗基因在哪里断裂，并为他们提供必要的信息来修改他们的基因设计，以防止在进一步的迭代中断裂。

使用Iso-Seq方法以前所未有的方式监视有效荷载序列的性能
评估拟引入宿主的潜在治疗基因是否会产生预期的治疗效果，如果不能则获取详细信息以了解用全长RNA异构体需要修改哪些基因。

即使完成了基因治疗和AAV载体的设计和制造步骤，最后也是最关键的一步是验证有效载荷是否具有预期的效果。没有其他技术能比Iso-Seq方法的HiFi测序提供评估有效载荷表达的长度和准确性。这就是为什么同源药物公司的Terrance Hanscom使用HiFi测序技术来研究和评估从实验治疗基因进入靶细胞后转录的完整mRNA亚型。

“从你的[治疗]基因中，你会有几种不同的mRNA亚型……如果你使用短读长测序技术，你[不会]知道读到的是哪一种RNA亚型，这对我们真的很重要，这个[问题]对我们的患者的安全性和有效性至关重要，pacBio的Iso-Seq方法解决方案向我们展示了我们到底提供了什么。这使得Iso-Seq方法的HiFi测序成为体内性能评估不可或缺的工具。使用Iso-Seq方法获得的完整亚型表达数据是基于aav的基因治疗研发管道的重要组成部分，使研发团队可以检查每个亚型，改进密码子优化模型等。

利用HiFi reads的力量，优化AAV基因治疗发展的每个阶段

HiFi测序解决方案允许基因治疗研究人员发现和观察AAV载体设计和发展的细节，这是前所未有的。HiFi数据使发现难以捉摸的新的AAV株成为可能，更适合您的治疗设计的要求。捕捉以前看不见的错误，并通过无需制备的碱基修饰检测和HiFi测序的精度，精确定位需要改进的结构区域。