艰难梭菌是一种造成医院和社区感染腹泻及肠炎的重要病原体，近年来在全球各地造成了一系列爆发性感染，被美国疾病预防控制中心列为最高级别威胁的耐药病菌。

艰难梭菌有5个主要进化分支，其中II型分支由于其强致病性又被称为超毒力分支，是近年来在北美、欧洲等地区造成数次爆发性感染的罪魁祸首。毒素B（TcdB）是艰难梭菌致病的关键因子，已有研究报道不同艰难梭菌分支表达的TcdB分属于数个不同亚型，部分亚型在毒理和病理上存在有明显差异。与其它分支的艰难梭菌不同，超毒力分支艰难梭菌专有表达的两种TcdB（TcdB2和TcdB4），均不识别经典的毒素受体FZD蛋白，其如何侵入肠上皮细胞是一个多年来悬而未决的关键问题。

（论文截图）

北京时间2022年3月17日23点，西湖大学生命科学学院的陶亮团队与施一公团队合作，在生物学期刊《细胞》（Cell）在线发表题为“TFpI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2 C. difficile”的研究论文，对这一领域内困扰多年的重要问题进行了详尽解答（图1）。

图1：图文摘要

在本研究中，陶亮团队发现FZD/CSpG4敲除的HeLa细胞对TcdB4依旧高度敏感，预示HeLa细胞表达有一种可以高效介导TcdB4入侵细胞的未知受体。由此研究者们采用了一种全基因组水平的基于CRISpR/Cas9的基因敲除文库筛选技术，对HeLa细胞文库进行多轮的TcdB4压力选择后获得了一系列相关的候选因子。经过分析，研究者们锁定Tissue Factor pathway Inhibitor（TFpI）的蛋白为TcdB4入侵细胞过程中的重要细胞因子候选，进行深入研究。（图2）

图2：(A)全基因组水平的CRISpR/Cas9基因敲除文库在HeLa中筛选与TcdB4作用相关的细胞因子；(B) CRISpR/Cas9筛选结果，采用NGS读数和靶向的gRNA数目进行二维展示；(C) CRISpR/Cas9筛选结果，根据每个基因的富集度排序。

利用基于CRISpR/Cas9技术的构建基因敲除细胞系、细胞膜表面蛋白酶处理、基因回补和过表达等细胞和分子生物学手段，作者们发现TFpI可在细胞表面结合TcdB4并介导后者进入胞内发挥生物学活性，从而起了细胞受体的功能。

之后，陶亮团队与同属西湖大学生命科学学院的施一公团队开展合作，利用冷冻电镜单颗粒三维重构技术解析了分辨率为3.1Å的毒素-受体复合物（TcdB4-TFpI）的三维结构（图3）。

图3：TcdB4和TFpI形成复合物的三维结构图

令人惊叹的是，TcdB4识别TFpI的结合界面与此前报道的TcdB1识别FZD的结合界面高度重合，展示了这类毒素一个在进化上保守、功能上分歧的受体结合区域。对该受体结合功能区域的序列作系统进化分析后发现，TcdB可以归为两个大类：第一类以TcdB1/3/5为代表，识别FZD作为受体；第二类主要包含超毒力分支艰难梭菌的TcdB2和TcdB4，选择识别TFpI作为受体（图4）。


图4：(A)毒素-受体复合物TcdB1-FZD2与TcdB4-TFpI的结构比较。(B)系统进化分析发现TcdB基于受体结合区域差异可分为两大类，分别识别FZD和TFpI。(C)艰难梭菌分支I、III、IV、V的TcdB识别FZD作为受体，超毒力分支II的TcdB识别TFpI作为受体。

接下来，通过构建敲除TFpI部分同源异构体的小鼠，研究者们继续在体内研究TFpI作为TcdB2和TcdB4受体的生理和病理学意义。通过腹腔注射TcdB4进行毒素挑战实验发现，野生型（TFpIβ+/+）和杂合型（TFpIβ+/‒）小鼠在注射一定剂量的TcdB4后的12小时内全部死亡，而超过60%的纯合型（TFpIβ‒/‒）小鼠存活了下来。对小鼠全身主要器官的病理切片研究发现，野生型小鼠的肾脏在毒素注射后病理表征显著，而纯合型小鼠肾脏几乎没有损伤。该实验结果不仅证明TFpI是在系统暴露于TcdB4下（模拟全身感染的情形）生理相关的关键受体，并且显示肾脏是主要的受损器官。

最后，研究者们利用经典的肠道结环模型探讨TFpI作为受体在超毒力艰难梭菌的TcdB破坏肠道上皮中的作用。相比TcdB2或TcdB4单独处理的对照组，实验组中含有TFpIK2区域的可溶性融合蛋白可以有效阻止超毒力分支艰难梭菌的TcdB对肠上皮的破坏，展现出显著的保护作用。该实验结果不仅进一步证实TFpI是超毒力艰难梭菌的TcdB在肠道上皮中的受体，并显示了利用可溶性TFpI作为中和蛋白在临床治疗和预防超毒力艰难梭菌感染中的潜在应用价值。

这项研究对于揭示和理解艰难梭菌感染的致病机制、及梭菌大毒素的进化和工作方式方面有着重要科学意义，并且为超毒力分支菌株引起的艰难梭菌感染的预防和治疗新方法的开发提供了重要的理论依据。

西湖大学生命科学学院的陶亮研究员（Lead Contact）和李颜颜研究员（施一公团队）为本文的共同通讯作者；西湖大学博士后罗建华、博士生杨琦、博士后张晓峰、科研助理张媛媛、博士后万里为共同第一作者。其它合作作者包括西湖大学的研究员黄晶博士和甄莹博士，博士后占谢超，博士研究生周瑶、贺柳晴、李丹阳，和杭州医学院的研究员金大智博士。此外还特别感谢波士顿儿童医院/哈佛医学院的董民教授和西湖大学生命科学学院李党生教授在项目进行过程中的支持与讨论。本课题受到国家自然科学基金、浙江省自然科学基金、西湖实验室（生命科学和生物医学浙江省实验室）及西湖教育基金会的资助；项目实施还得到了西湖大学生物医学实验技术中心、实验动物中心和高性能计算中心的支持和帮助。

陶亮课题组简介与招聘信息

西湖大学微生物宿主交互实验室（实验室主页：https://tao.lab.westlake.edu.cn/）致力于研究微生物-宿主之间的相互作用方式和内在规律，尤其是从分子、生化、细胞、生信、结构等方面研究重要病原细菌及其致病因子对宿主的影响及作用机制。西湖大学生命科学学院研究员陶亮近年来以第一和通讯作者在Cell、Nature、Science、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Communications、pLOS pathogens等学科主流期刊上发表多篇学术论文。实验室目前有多个博士后、博士生和科研助理岗位，方向包括且不限于分子微生物学、生物信息学和微生物组学、微生物遗传学、免疫学、结构生物学、生物化学、细胞生物学等，诚邀各方青年才俊加入、携手共同成长！（联系方式：[email protected]）