作者：俞晓峰 赛业生物首席科学家/中国区副总裁

应用基因编辑小鼠模型研究基因的功能、揭示疾病致病机制过程，为药物研发的临床前研究，发挥了不可取代的作用。Cre-loxp位点特异性重组系统（简称Cre-loxp重组系统）的建立，为完善基因编辑小鼠模型的构建，进一步开展条件性靶基因功能的研究，提供了有效工具。回顾Cre-loxp重组系统在小鼠研究中的实际应用，研究者们认识到，对该技术应用中存在的某些风险与影响因素，给予充分了解与关注，将有助于提升靶基因编辑小鼠模型研究结果的准确性与可靠性。

文章亮点
一、Cre-loxp位点特异性重组系统应用基本原理
二、应用Cre-loxp位点特异性重组系统，实现小鼠条件性靶基因功能研究
三、不同Cre小鼠模型构建策略及方法特点
四、为什么要构建诱导性调控CreERT小鼠模型及其基本特征
五、Cre转基因小鼠模型中Cre插入位点鉴定的挑战与重要性
六、Cre-loxp位点重组系统应用中常见风险及影响因素
七、Cre-loxp位点特异性重组系统应用中的思考与建议

正文

一、Cre-loxp位点特异性重组系统应用基本原理

所谓Cre-loxp位点特异性重组系统，源于噬菌体p1中，存在Cre重组酶（343个氨基酸蛋白，4个亚单位组成）及其能特异识别的一对34 bp的DNA序列（即loxp位点），并根据两个loxp位点的方向性，将两loxp位点之间的DNA序列（也称floxed区域）进行特异性重组切割或反转。

如果在相应细胞/组织内特异性表达Cre重组酶, 且细胞/组织内也含两个loxp位点序列的floxed靶区域，则可使Cre-loxp系统的重组作用，局限于特定细胞或组织，实现体内靶基因特异性敲除或表达的目的。 T细胞特异性Cre转基因小鼠最先构建，为条件性靶基因在T细胞中的功能研究提供了条件。

二、应用Cre-loxp位点特异性重组系统，实现小鼠条件性靶基因功能研究

要想实现小鼠条件性靶基因编辑及功能相关研究，前提是分别获得两种小鼠模型：即构建含两个loxp位点序列floxed靶基因的小鼠和细胞/组织特异性表达Cre小鼠。 比如，为了开展某靶基因的条件性敲除（CKO)研究, 首先要构建该靶基因的打靶载体，即将两个loxp位点分别克隆到该靶基因DNA区域的两端，再借助CRISpR/Cas 受精卵注射或赛业生物TurboKnockout囊胚注射技术，建立所谓的靶基因floxed小鼠，即小鼠模型在某靶基因计划敲除的特定floxed区域，已经携带了两个同向的loxp位点。将该floxed小鼠与某特定细胞/组织特异性表达的Cre小鼠进行交配，就能获得该靶基因在此特定细胞/组织敲除的小鼠模型。

最终完成Cre-loxp系统条件性靶基因编辑小鼠研制的操作，通常需要通过floxed小鼠与相应Cre小鼠间的两步遗传交配繁殖过程。第一步交配，X基因Cre杂合小鼠（X基因Cre/+）与Y基因 floxed杂合小鼠（Y基因 lox/+，即CKO打靶Y基因)，或Y基因 floxed纯合小鼠（Y基因lox/lox）交配，获得X基因Cre/+; Y基因lox/+ 后代杂合小鼠。第二步交配，将X基因Cre/+; Y基因lox/+杂合小鼠，再与Y基因lox/+杂合小鼠，或Y基因lox/lox纯合小鼠交配，从而获得最终X基因Cre/+；Y基因lox/lox条件性打靶小鼠。

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如果Cre表达是严格调控的，且无生殖系统或发育过程表达现象，第二步交配的后代小鼠, 只有X基因Cre/+; Y基因lox/lox小鼠，可作为条件性靶基因打靶的小鼠模型研究，即Y基因的两个等位基因，在Cre重组酶特异性表达活性的组织细胞中，被有效重组切割的目的。

然而，如果Cre存在生殖系统泄露表达情况，在第一步交配后，有可能对X基因Cre/+; Y基因lox/+杂合小鼠，进行生殖性重组切割作用，产生X基因Cre/+; Y基因Δ/+小鼠（Δ代表Y基因某个等位基因在某些细胞或所有细胞敲除），这样的话，第二步交配，就是X基因Cre/+; Y基因Δ/+杂合小鼠，与Y基因lox/+杂合小鼠，或Y基因lox/lox纯合小鼠进行交配。如果此时，还是用常规两个引物的pCR鉴定策略，很难鉴别出非预期的生殖系基因敲除现象，必需借助设计三个引物组合的pCR鉴定策略加以确定。

三、不同Cre小鼠模型构建策略及方法特点

目前有四种常见Cre小鼠模型构建策略及方法，虽然每种方法都有其优势与不足，也很难说那种策略方法，能够适合或满足所有研究目的。所以，最终选择哪种方法，还是要根据研究目的具体情况决定。

1. 质粒表达载体的转基因Cre小鼠模型：认为是Cre小鼠构建的传统方法，因为最初的Cre小鼠模型，多是应用特定启动子加Cre基因cDNA的质粒载体，通过受精卵原核注射法，获得Cre随机插入基因组的转基因小鼠。

由于启动子大小的限制，只选择了一定范围的表达调控元件序列，构建Cre表达载体，加上转基因随机插入基因组的位置效应影响、拷贝数的差异、以及内源基因可能破坏等因素，使每个Cre首建鼠存在个体差异，且需要通过对每个首建鼠特征进行筛选与鉴定，获得特定理想的Cre转基因小鼠模型。 因此，通过传统转基因技术构建的Cre小鼠模型，出现所谓Cre作用的“脱靶（off-target）” 活性，也就不奇怪了。

2. 定点敲入Cre小鼠模型：将Cre基因定点敲入相关内源基因位点，借助内源性基因调控序列确定Cre表达特征，已成为传统转基因Cre小鼠构建的替代选择，也增加了Cre基因表达活性的精确性。

应用CRISpR/Cas或赛业生物TurboKnockout的ES打靶技术方法，将单拷贝Cre定点敲入相关内源基因位点，按以下几种策略方式敲入：（1）. 特定内源基因翻译启始位点; （2）. 借助IRES序列连接，将Cre基因敲入内源基因的3’ UTR区域；（3）. 借助2A“自切割”肽连接，将Cre基因替换并敲入内源基因的终止密码处。

一般而言，直接将Cre敲入特定内源基因的翻译启始位点的策略，往往会同时破坏了该基因的表达。有研究发现，因Cre敲入到生长发育或疾病通路等至关重要相关基因中，导致相应Cre小鼠，出现影响基因功能的潜在非特异性表型。比如，Foxg1-Cre敲入小鼠模型，杂合Cre小鼠即出现小鼠前脑发育障碍。所以，该策略只适合于哪些杂合缺失无表型的相关基因。而应用IRES和2A敲入策略，避免了由Cre特定位点敲入，可能引起的杂合缺失表型的不足。

关于IRES与2A肽两种连接敲入策略的比较，通常认识是，传统的IRES敲入策略，几乎不会影响内源基因的功能，但也发现，由于传统经典的ES打靶过程中，Neo基因表达成分，或去除其后遗留的相关FRT序列等遗留部分序列，可能会引起内源基因3’ UTR区域结构改变，从而干扰了Cre的表达水平，使其实际表达量会相对低于内源基因本身。而新型2A肽连接敲入方式，Cre表达量与其内源基因表达几乎相似，但由于切割2A肽后，遗留的约17-21氨基酸序列，可以附着于内源基因c-端蛋白，存在潜在影响内源蛋白功能的可能性。已有研究表明，不同的2A肽序列 (p2A, T2A, E2A, F2A) 具有不同自切割效率。 尽管如此，应用敲入3"端策略，已不断赢得其吸引力。

3. BAC转基因Cre小鼠模型：将Cre基因先敲入至BAC克隆的特定基因调控元件序列后，构建BAC克隆载体，并将此BAC载体进行受精卵原核注射法，构建BAC转基因Cre小鼠模型。虽然该转基因技术也是随机整合插入，但其具有降低了质粒DNA随机插入引起的位置效应影响，避免了Cre基因5’ 端敲入可能引起的杂合缺失有表型等方面的优势。另外，相对于短启动子的表达质粒转基因而言，BAC载体包含了更多的基因表达相关的调控元件序列，因而更能反映内源基因的表达特征。但是，BAC转基因的首建鼠，仍会出现因BAC克隆载体插入位点的不同，而引起Cre表达活性不同的现象。因此，该方法并不能解决传统转基因技术的所有不足，比如，插入位点染色质结构的局部影响作用，以及潜在基因插入突变，造成Cre非真实表达等风险。而且，在BAC转基因Cre小鼠构建的同时，也可能增加了附带相应基因的拷贝数，从而干扰了相关基因功能研究的客观分析。尽管如此，相对于传统较小启动子的Cre表达载体而言，BAC转基因技术还是具有其明显的优势。

4. 安全位点敲入Cre小鼠模型：目前最新的Cre小鼠模型构建策略。为了避免基因随机插入可能导致诸多不利因素影响（比如表达位置影响作用及插入突变等），通过将Cre定点敲入到所谓的“安全” 位点，比如 Rosa26、Hprt 和 Hipp 11等位点。其中以Rosa26位点最为常用。

Rosa26位点特点，其本身含有基因转录的广泛启动子，形成mRNA，却无翻译蛋白。所以，该基因无特定功能。借用该基因位点本身的特点与优势，有助于构建全身表达Cre基因单拷贝定点敲入小鼠模型。而Hprt和Hipp11位点则比较适合构建组织特异性敲入Cre小鼠模型。

四、为什么要构建诱导性调控CreERT小鼠模型及其基本特征

前面介绍的Cre小鼠模型，其作用特异性及特征，是由引导Cre表达的基因启动子特征或构建策略方法决定的。由于许多所谓特异性基因的表达，贯穿了整个细胞/组织的胚胎发育成熟过程。而由这类基因特性启动子构建的所谓细胞/组织特异性Cre小鼠，其Cre活性作用，可能始于小鼠的胚胎时期。如果研究的靶基因又是小鼠生长发育非常重要的基因，过早实施Cre-loxp重组系统作用，有可能导致胚胎发育期靶基因的敲除，产生生殖系基因敲除小鼠的结果，也就难以实现细胞组织的特异性敲除靶基因的目的。所以，如何控制Cre表达的时间，使其成为可被诱导调控，即通过使用诱导物的方式，可以掌控Cre表达时间，结合细胞/组织特异性Cre特征，达到时空条件性靶基因敲除/表达的研究目的。

所谓可诱导性调控CreERT系统，是将Cre基因与雌激素受体（ER）配体结合域突变体（ERT）融合一起构建而成。该ERT只与合成的ER配体结合，比如4-羟基他莫昔芬（为药物Tamoxifen的活性代谢物）。 在无该诱导剂存在下，CreERT融合蛋白与细胞浆中HSp90结合，以非活性状态存在于细胞浆，无法发挥Cre-loxp重组系统作用。当对CreERT/floxed小鼠体内提供药物诱导剂Tamoxifen (TAM），Cre蛋白与HSp90蛋白分离，进入细胞核，识别靶基因中的loxp位点，发挥Cre-loxp位点细胞/组织特异性及时间特定的重组切割作用。

CreERT小鼠为雌激素受体配体结合域中只有一个突变位点（G521R），目前常用的CreERT2小鼠，则是在相应配体结合域中引入3个突变位点（C400V/M453A/L544A), 大大提高了其对诱导物TAM的敏感性与特异性。

在特定时间和部位发挥诱导Cre-loxp重组切割作用能力，无疑极大提高了实验研究的灵活性。同时也增加了研究者实际应用该诱导性Cre-loxp特异性重组系统的挑战性，比如，对于该系统可能出现的包括Cre泄露表达作用，以及可能的毒性作用等，都需要研究者在实际应用中倍加谨慎小心。

五、Cre转基因小鼠模型中Cre插入位点鉴定的挑战与重要性

目前常用的Cre小鼠模型中，采用传统转基因策略构建的小鼠模型仍是占比最大。然而，对于转基因小鼠模型中，基因随机插入位点的相关鉴定研究占比非常少。有分析数据表明，只有不到5.2% ( 416/8012 ) 转基因小鼠模型，研究报道了基因随机插入的位点，而其中只有约2.3%（36/1631）转基因Cre小鼠品系，明确分析了其插入位点，提示分析鉴定转基因随机插入位点所面临的挑战性。

为什么需要鉴定分析转基因随机插入位点？第一，有利于转基因小鼠特定基因型引物的设计，便于纯合Cre小鼠的鉴定；第二，有助于条件性靶基因实验研究中，相关基因型鉴定分析策略及特异性pCR引物设计；第三，了解可能潜在的插入突变引起的非期望表型，比如随机插入导致的直接或间接的内源基因编码序列，或附近相关调控序列的破坏改变，以及引起反转/复制等的复合结构改变等。

应用靶向位点扩增（Targeted locus amplification -TLA）技术，能有效分析鉴定随机转基因插入位点与插入基因性质特征。 有研究者应用该技术，对选择的40多种常用的转基因Cre小鼠模型，进行分析研究发现，有30种Cre小鼠模型，由于基因的随机插入，导致了相应基因组结构性变化，其中包括24种小鼠出现基因结构的缺失，6种出现结构重复。 50 % 转基因Cre小鼠内源性基因受损，且多表现为DNA大片段缺失和/或插入位点相关基因结构改变。由于随机插入导致的基因结构改变，可诱发非期望的相关表型，从而影响到Cre-loxp重组特异性靶基因实验结果的准确性。（未完，后继精彩内容请点击继续阅读）

后文链接：

技术连载之2：Cre-loxp位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用

技术连载之3：Cre-loxp位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用