CRISPR女神发文:使用两种CRISPR酶,只需20分钟即可诊断出新冠病毒!
虽然今天的COVID-19诊断检测的黄金标准使用qRT-pCR(定量逆转录酶-聚合酶链反应(pCR))非常敏感,每微升检测到一个RNA拷贝,但它需要专门的设备,运行时间长达数小时和中央实验室设施。因此,测试通常需要至少一到两天的时间。
加州大学伯克利分校(University of California, Berkeley)的Jennifer Doudna、David Savage和patrick Hsu实验室的科学家领导的一个研究团队,正致力于开发一种比qRT-pCR更快速、更容易部署的诊断测试。研究人员结合了两种不同的CRISpR酶,创造了一种能在不到一小时内检测到少量病毒RNA的检测方法。其中Doudna因发明CRISpR-Cas9基因组编辑技术而分享了2020年的诺贝尔化学奖。
虽然这项新技术还没有达到qRT-pCR的敏感性,即可以检测每微升中病毒的几个副本,但它已经能够达到检测的水平——每毫升30份拷贝,这足以用来监督传播感染。
“如果这种检测足够方便和快速,就不需要pCR的敏感性来基本捕捉和诊断社区中的COVID-19,”该研究的合著者、分子和细胞生物学教授David Savage说,“我们的希望是将生物化学发展到一种非常方便的形式,在这样的环境下,每天都可以接受测试,比如在上班的入口处。”
这一研究成果8月5日在线发表在Nature Chemical Biology杂志上。
取舍之间
FDA紧急授权了几个以CRISpR为基础的检测方法,但都需要一个初始步骤,也就是病毒RNA的放大,以便检测信号。虽然这种最初的扩增将检测的灵敏度提高到与qRT-pCR相似的水平,但它也引入了一些步骤,使检测更难在实验室之外进行。
加州大学伯克利分校领导的研究小组试图在不牺牲检测简单性的情况下达到有用的灵敏度和速度。
“对于检测应用程序,我们想有一个快速反应,这样人们就可以很快知道如果他们感染了,之前你上飞机时,例如,或去拜访亲戚,”文章一作 Tina Liu 说。
除了增加步骤之外,初始扩增的另一个缺点是,因为它会产生数十亿个病毒 RNA 拷贝,所以患者样本交叉污染的可能性更大。该团队开发的新技术扭转了这一点,增强了荧光信号,消除了交叉污染的主要来源。
这种无扩增技术,研究人员称之为 Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem (串联快速集成核酸酶检测,FIND-IT,生物通注),可以为许多其他传染病提供快速且廉价的诊断测试。
“虽然我们确实为了影响 COVID-19 而启动了这个项目,但我认为这种特殊的技术不仅仅适用于此次疫情,因为最终 CRISpR 是可编程的,因此,可以将针对流感病毒或 HIV 病毒或任何类型的 RNA 病毒的序列加载到 CRISpR 酶中,该系统会以相同的方式工作。这篇论文确实证明了这种生物化学方法是一种更简单的检测 RNA 的方法,并且可以在敏感和快速的时间范围内检测RNA,这可能适用于未来在即时诊断中的应用。”
研究人员目前正在使用 FIND-IT 构建诊断程序,其中包括收集和处理样本以及在紧凑型微流体设备上运行检测的步骤。
串联 Cas 蛋白
为了去除扩增这一步骤,该团队采用了一种 CRISpR 酶——Cas13,首先检测病毒 RNA,并使用另一种称为 Csm6的 Cas 蛋白来放大荧光信号。
Cas13 是用于切割 RNA 的通用剪刀:一旦它结合到由导向 RNA 指定的目标序列,它就会准备切割范围广泛的其他 RNA 分子。这种目标触发的切割活动可用于将特定 RNA 序列的检测与荧光报告分子的释放结合起来。然而,就其本身而言,当存在极少量的目标 RNA 时,Cas13 可能需要数小时才能产生可检测的信号。
这项研究的巧妙之处就是利用Csm6来放大Cas13的效果。 Csm6 是一种 CRISpR 酶,可感知 RNA 小环的存在,并被激活以切割细胞中的各种 RNA 分子。
为了促进 Cas13 检测,研究人员设计了一种特殊的激活剂分子,当 Cas13 检测到病毒 RNA 时,该激活剂分子会被切割。该分子的一个片段可以结合并触发 Csm6,从一段 RNA 中切割并释放出明亮的荧光分子。通常,激活剂分子会被 Csm6 迅速分解,从而限制了它可以产生的荧光信号的数量。Liu 和她的同事设计了一种化学修饰激活剂的方法,使其免受降解,并可以为 Csm6 增压以反复切割和释放与 RNA 相关的荧光分子。这导致灵敏度比原始活化剂好 100 倍。
“当 Cas13 被激活时,它会切割这个小激活剂,去除保护它的片段,”Liu说,“现在它被解放了,它可以激活第二种酶 Csm6 的许多不同分子。因此,Cas13 识别的一个目标不仅会激活其自身的 RNA 切割能力;它还导致产生许多更活跃的酶,每个酶都可以切割更多的荧光报告基因。”
研究人员团队还整合了优化的导向 RNA 组合,使 Cas13 能够更灵敏地识别病毒 RNA。当它与 Csm6 及其激活剂结合使用时,该团队能够在短短 20 分钟内检测到每微升低至 31 个拷贝的 SARS-CoV-2 RNA。
研究人员还将从患者样本中提取的 RNA 添加到微流控盒中的 FIND-IT 分析中,查看该分析是否适用于在便携式设备上运行。使用带有摄像头的小型设备,他们可以检测从患者样本中提取的 SARS-CoV-2 RNA,其灵敏度可以在峰值时捕获 COVID-19 感染。
“这种串联核酸酶方法——Cas13 加 Csm6,在 37°的单一温度下将所有东西组合成一个单一的反应,因此它不需要高温加热或多个步骤,这是其他诊断技术所必需的,”Liu说,“我认为这为更快、更简单的测试开辟了机会,这些测试可以达到与其他当前技术相当的灵敏度,并且可能在未来达到更高的灵敏度。”
这种用于RNA 检测的无扩增方法的开发是由于疫情开始解决 COVID-19 诊断和治疗问题时 IGI 内部的研究重新定位。最终,加州大学伯克利分校的五个实验室和加州大学旧金山分校的两个实验室参与了这个研究项目,这是 IGI 中的众多实验室之一。
“当我们开始这个项目时,我们希望创造出与 pCR 相当但不需要扩增的东西——这是我们的梦想,”该项目的首席研究员 Savage 说,“从敏感性的角度来看,我们有大约一万倍的差距。我们已经做到了大约一千倍;我们已经把它降低了大约三个数量级。所以,我们快到了。去年四月,当我们真的开始将其绘制出来,这似乎几乎不可能。” (生物通)
原文参考:
1.Tina Y. Liu, Gavin J. Knott, Dylan C. J. Smock, John J. Desmarais, Sungmin Son, Abdul Bhuiya, Shrutee Jakhanwal, Noam prywes, Shreeya Agrawal, María Díaz de León Derby, Neil A. Switz, Maxim Armstrong, Andrew R. Harris, Emeric J. Charles, Brittney W. Thornton, parinaz Fozouni, Jeffrey Shu, Stephanie I. Stephens, G. Renuka Kumar, Chunyu Zhao, Amanda Mok, Anthony T. Iavarone, Arturo M. Escajeda, Roger McIntosh, Shineui Kim, Eli J. Dugan, Jennifer R. Hamilton, Enrique Lin-Shiao, Elizabeth C. Stahl, Connor A. Tsuchida, Erica A. Moehle, petros Giannikopoulos, Matthew McElroy, Shana McDevitt, Arielle Zur, Iman Sylvain, Alison Ciling, Madeleine Zhu, Clara Williams, Alisha Baldwin, Katherine S. pollard, Ming X. Tan, Melanie Ott, Daniel A. Fletcher, Liana F. Lareau, patrick D. Hsu, David F. Savage, Jennifer A. Doudna. Accelerated RNA detection using tandem CRISpR nucleases. Nature Chemical Biology, 2021; DOI: 10.1038/s41589-021-00842-2