2.软和硬组织同时清除法

开发者：德州农工大学的Hu Zhao团队

问题：现有的清除方案不能同时清除软组织，如脑和脊髓，以及钙化的硬组织，如骨。这使得想象中枢和外周神经系统之间完整的连接变得很困难，因为脊髓中的外周神经与脊椎相连，而且椎骨太不透明而无法成像。

方法：Zhao和他的团队开发了一种程序，他们将其命名为pEGASOS（聚乙二醇相关溶剂系统），以同时清除软组织和硬组织（Cell Rese，28:803–18，2018）。这一过程与其他清除方案类似，只是它使用聚乙二醇（pEG）增强荧光保存，并包含两个附加步骤：硬组织脱钙和有色组织（如肝脏）的脱色，因为肝脏含有高水平的铁，所以看起来是红色的。对于那些使用小身体部位的人，组织可以被动地浸入化学试剂中。或者，可以使用灌注泵在全身循环清洗溶液。

研究人员使用pEGASOS追踪大鼠脊柱两个不同节段之间的单个轴突，并在不通过手术将其与脊椎分离的情况下，观察脊髓内的神经元。他们还观察了骨髓中神经的三维分布，发现神经在某些骨区域的空间分布很丰富。

缺点：pEGASOS处理后，组织收缩30%到40%，这可能会扭曲组织结构。

用时：对于浸泡的软/硬组织，清理大约需要7到12天。全身清洁需要更长时间，因为清洗液必须循环10天，幼鼠的整个清除过程达到3周。对于组织较多的成年大鼠，循环过程的持续时间必须加倍。这将整个用时延长到一个月左右。

下一步是什么？对于所有类型的组织，组织收缩可能并不均匀。Zhao计划开发一种改进的pEGASOS化学配方来克服这一挑战。研究小组还计划减少人体蛋白质的自然荧光发射，这些蛋白质会在与组织收缩相关的数据中产生噪音。

小贴士：组织清除只是第一步，Zhao说，随后的成像和数据处理更具挑战性。他建议新用户从薄薄的组织切片开始，而不是整个器官来熟悉整个工作流程。这项技术有预配液；Zhao估计清理一整只鼠的大脑大约需要30美元。

3.放大清洗法

开发者：东京大学Hiroki Ueda团队

问题：大多数现有的大脑清理技术并不能使组织完全透明，这使得构建单细胞分辨率的大脑地图变得困难。

方法：在筛选了近1700种化学物质后，Ueda和他的同事开发了一种称为CUBIC-X的方法，用于放大清理后的脑组织（Nat Neurosci，21:625–372018）。他们将组织浸泡在通过化学筛选确定的亲水性试剂中，使大脑体积扩大约为最佳容积膨胀的10倍，因为此后组织可能变得脆弱。利用他们的研究方案，Ueda和他的同事们能够在不丢失任何细胞的情况下对1厘米厚的小鼠大脑进行成像。而且由于扩张的组织是99%的水，所以整个大脑各层的折射率基本保持不变。这使得组织变得透明，并允许近100%的光透射用于单细胞分辨率成像。

缺点：用于扩大组织的化学物质倾向于熄灭标记神经元和亚细胞成分（如RNA）的荧光信号。

用时：用CUBIC-X清除整个小鼠大脑的组织大约需要16天。

下一步是什么？未来，Ueda希望将CUBIC-X应用于其他器官，包括心脏和肺。他还计划利用这项技术清除大型哺乳动物的大脑，如非人灵长类和人类。

小贴士：研究人员创建了CUBIC图谱，这是一个带有单细胞注释的开放式小鼠大脑图谱。用户可以将他们的数据与图谱进行比较，以评估大脑清理的可重复性。CUBIC-X在商业上是可以买到的（每25毫升50美元，足够一个鼠的大脑）。

4.盾牌（SHIELD）保护法

开发者：麻省理工学院Kwanghun Chung团队

问题：在组织清理过程中，酶和化学物质被用来消化组织，去除脂质，有时还会使样本脱水。除了熄灭标记分子的荧光信号外，这些过程不可避免地降解了蛋白质和RNA，破坏了关键的分子信息。

方法：Chung和他的同事们利用一种叫做聚环氧化合物的材料来解决这个问题。环氧树脂在航空航天工业中被广泛用作胶水，为木材等较弱的材料提供结构支撑。在分子水平上，它有助于维持蛋白质结构。这一点很重要，因为蛋白质三维形状的微小变化会导致它失去荧光和结合能力。

研究小组筛选了六种类型的环氧化物，并通过计算模拟确定了一种最能保持绿色荧光蛋白（GFp）荧光的环氧化物。然后将环氧化合物注入小鼠的脑组织中进行基因修饰。在那里，环氧树脂与绿色荧光蛋白反应形成柔性化学键。这些键保护了GFp在组织清除过程中的变性，并允许GFp在组织清除后重新折叠回其自然构象。

Chung和他的同事们展示了他们称之为SHIELD（通过分子内环氧化物连接稳定到恶劣条件以防止降解）的技术，保持了荧光蛋白信号。它还保护了组织清除后蛋白质与抗体结合的能力，以及RNA转录物与RNA探针的能力（Nat Biotenol，37:73–83，2019）。研究小组将屏蔽和组织清除结合起来，用单细胞分辨率成像出2毫米厚的人脑和小鼠大脑片段。

用时：屏蔽组织治疗整个小鼠大脑大约需要4天。随后的组织清除需要额外的4到6天，总共两周。

下一步是什么？该研究小组计划将SHIELD应用于较大的器官甚至肿瘤上。他们还开发了一种改进的系统，以促进抗体穿透组织，从而更快地进行标记。

小贴士：由于环氧化物的处理，屏蔽处理过的组织更坚硬，抗体穿透速度较慢，因此整个小鼠大脑的抗体标记需要更长的两天时间。SHIELD可在Life Canvas Technologies公司购买。清理一只鼠的大脑16美元就足够了。