正如世界上没有两片相同的树叶，组织中也没有两个相同的细胞。不过，传统技术以数百万个细胞作为样本，难以捕获这种异质性。它们产生的平均值往往掩盖了细胞间重要的转录差异。为了更好地了解单个细胞对人体健康的贡献，如今人们开始转向了单细胞研究。

RNA-FISH、单细胞RT-qpCR和单细胞RNA测序（RNA-Seq）都是目前流行的单细胞转录组学技术。近日，Bio-Rad的科学家讨论了每种方法的优缺点，并介绍了新推出的Illumina® Bio-Rad®单细胞测序解决方案。

传统技术的限制

RNA-FISH是一种基于显微镜的方法，它利用荧光标记的探针，对固定细胞或组织中的单个转录物进行计数。与其他单细胞方法不同，RNA-FISH提供空间信息，不过，每次实验可分析的基因数量有限。每个目标RNA都需要分配一个荧光基团，因此可以同时拷问的基因数量很少。

单细胞RT-qpCR方法可以研究更多的基因。在使用96孔板时，这种方法最多可分析96个细胞中的1-10个基因。通过使用微流体芯片，通量还可以增加到96个细胞中的96个基因。不过，这种方法只能深入研究一小部分转录活性的基因。

此外，这两种方法还有一个限制——它们需要先验知识来设计适当的探针和引物。这使得这些方法只适合监控已知基因的表达模式，而不适合发现新的生物标志物。由于这些限制，单细胞RNA-Seq脱颖而出，成为一种极具吸引力的单细胞分析方法。

单细胞RNA-Seq能够拷问上千个细胞中上千个基因的表达，让人们深入了解过去难以鉴定的过程和现象，比如肿瘤的细胞异质性、神经细胞的分类等。当然，单细胞的分离仍然是挑战。Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案通过独特的微滴分液来分离单个细胞，从而实现了大规模的基因表达谱分析。

一个简单的流程

Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案利用Bio-Rad的Droplet Digital™技术，来捕获纳米大小微滴中的单细胞，此微滴中包含了细胞裂解和标记的所有试剂。每个细胞在其各自的微滴中被裂解，而每个转录本被标上独特的分子条形码（UMI）。然后，将所有微滴的cDNA混合进行第二链合成，再利用Illumina的Nextera® tagmentation技术进行文库制备。

之后，文库可以在Illumina的MiSeq、NextSeq、NovaSeq等系统上测序，产生的数据可通过BaseSpace平台中的SureCell™ RNA Single-Cell App进行分析。利用FlowJo的 SeqGeq软件，研究人员能够鉴定和探索亚群和差异表达的基因，同时轻松生成可发表的图片。

一些成功的案例

Bio-Rad利用这个解决方案克服了传统方法的一些挑战。传统单细胞RNA-Seq方法的挑战之一是细胞大小。常规方法只能从10-25 µm的细胞中生成高质量的数据，但对较大的细胞（如心肌细胞和脂肪细胞）无能为力。

利用Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案，研究人员对1077个大小在40-100 µm的脂肪细胞成功开展测序。他们从每个细胞中获得了16,085条转录本和4,616个基因的高质量序列。

传统方法的另一个挑战是小的部分，比如细胞核（6 µm）。目前的分析方法需要制备单细胞悬液，但对于那些难以解离的组织（如神经系统）而言，这颇有挑战性。利用这个新方案，研究人员成功分离并测序了548个细胞核。与预期一致，细胞核产生的转录本比全细胞少。

研究人员认为，Illumina Bio-Rad单细胞测序解决方案能够快速高效地绘制数万个细胞的转录组，识别和追踪感兴趣的细胞亚群，这无疑能够更好地了解疾病状态，并帮助人们开发出更有效、更靶向的个性化疗法。

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