2017年1月23日由中科院昆明动物所离子通道药物研发中心、美国哥伦比亚大学和清华大学合作完成的最新研究成果Structural basis of Ca2+/pH dual regulation of the endolysosomal Ca2+ channel TRpML1在《自然》（Nature）杂志子刊Nature Structural & Molecular Biology上在线发表。研究人员综合运用X射线晶体学、生物化学、冷冻电子显微镜和电生理等技术手段，解析了IV型粘脂质贮积症（MLIV）关键蛋白TRpML1的重要结构域的高分辨率三维结构，揭示了生理条件下的理化因素（钙离子和酸性pH）对TRpML1的调控机制以及TRpML1功能失调和MLIV相关基因突变的直接相关性。

溶酶体是一种细胞器，即细胞内的一种超微结构，为单层包被的囊泡，可降解细胞内的各种生物大分子，并为新的生物大分子提供原料，是细胞的处理与回收系统。溶酶体功能缺陷直接导致生物大分子不能正常降解而在溶酶体中贮积，其结果是溶酶体随之发生肿胀，细胞也变得臃肿失常，细胞功能受到严重影响，最终导致疾病，称为溶酶体贮积症。MLIV为溶酶体贮积症的一种，其症状表现为智力发育迟缓、眼功能异常（如视网膜变性，角膜混浊）、铁和胃酸缺乏。患有MLIV的儿童在一岁时常表现出认知、语言和运动障碍。研究发现瞬时受体电位通道成员TRpML1是MLIV的遗传致病决定性因素，多达20余种TRpML1基因突变可导致MLIV。TRpML1主要定位在后期内涵体和溶酶体，该通道具有一些非常重要的特征：如受 pH 和Ca2+ （溶酶体内pH值约为4.5，含 0.5 mM Ca2+）调节，通透Ca2+ 和 Fe2+（溶酶体含高浓度的此类二价离子）等。然而，这些特征的分子和生物物理机制，这些机制是否对TRpML1在溶酶体中的生理功能起至关重要的作用，以及溶酶体贮积症相关基因突变所造成的TRpML1功能失调的分子机制目前尚不清楚。

针对上述问题，中科院昆明动物所离子通道药物研发中心、美国哥伦比亚大学和清华大学合作对TRpML1通道进行了深入的结构功能研究。为了了解钙离子和酸性pH对TRpML1调控的机制，研究人员重点研究了该通道第I、II跨膜片段（TM1 和TM2）之间的一个长连接片段I-II linker，此结构域内的3种氨基酸点突变均会导致MLIV。他们获得了I-II linker在三种不同pH值下的晶体结构，这三种pH对应于溶酶体、后期内涵体和细胞表面膜的pH值。结构显示I-II linker为旋转对称的四聚体，四聚体中央形成一个直径为14 Å的腔孔（luminal pore），通过由16个氨基酸残基组成的腔孔环连接。钙离子和质子作用于此腔孔，从而双重调控TRpML1通道活性，符合溶酶体内的低pH值和高浓度钙离子的理化特征。随后他们使用冷冻电镜对这一结构进行进一步验证，获得全长TRpML1的胞外域分辨率为5.28Å的结构。此胞外域绝大部分由I-II linker组成，是一个四聚体，且中心有一个很大的孔，这一结构与I-II linker的晶体结构高度吻合，表明I-II linker的片段晶体结构的正确性。此外，MLIV致病突变会改变这一结构域的结构并且导致TRpML1通道蛋白的细胞内运输发生错误。这一研究首次为了解TRpML1这一重要蛋白的调控，组装，功能以及MLIV致病的分子机理提供了结构基础，具有重要的科学意义，也为MLIV的治疗提供了新思路。


　图a：钙离子和pH值对TRpML1通道的双重调节。图b：从膜上方所视的TRpML1通道I-II linker的四聚体结构。图c：从膜上方所视的I-II linker单体结构。图d：腔孔环结构的局部放大，只显示了三个亚基，最前方的亚基未予显示以方便观察

昆明动物所杨建研究员为本文通讯作者，美国哥伦比亚大学生物科学系副研究员及昆明动物所访问学者李明晖博士和昆明动物所张炜副研究员为本文共同第一作者，清华大学李雪明教授为本文共同作者。这一研究得到了科技部973项目，国家自然科学基金面上项目，云南省科技厅海外高端人才，云南省高层次人才项目，青年****以及美国国立卫生研究院等多项基金项目的支持。

作者简介：

杨建
研究员
客座研究员，现任离子通道药物研发中心主任，美国哥伦比亚大学生物科学系教授。自1978年起至今，先后在北京大学、中国科学院上海脑研究所、美国西雅图华盛顿大学、斯坦福大学、加州大学旧金山分校等高等学府学习深造，1997年任美国哥伦比亚大学生物科学系助理教授，2002年任副教授，2009年任教授。得到了来自Sloan, EJLB和McKnight 基金会的学者奖以及美国心脏病学会的学者成就奖。曾担任美国国立卫生研究院（NIH）的基金评委和美国生物物理杂志(Biophysical Journal) 的编委。在physiological Reviews、Nature、Nature Neuroscience、Neuron、pNAS等国际著名学术期刊上发表论文。

教育和工作经历
1978.9 -1982.7 北京大学，生物系生物物理专业，获理学学士学位
1982.8 -1985.7 中国科学院上海脑研究所，神经生理专业，获理学硕士学位
导师：沈克飞教授
1985.12-1987.8 美国科罗拉多州立大学，解剖与神经生物学系，访问学者
导师：Stephen D. Roper教授
1987.9- 1991.6 美国西雅图华盛顿大学，生理及生物物理系，获博士学位
导师：Bertil Hille教授
1991.8-1993.12 美国斯坦福大学，分子与细胞生理学系，博士后
导师：Richard W. Tsien（钱永佑）教授
1994.1-1996.12 美国加州大学旧金山分校和霍华德休斯医学研究院, 博士后
导师： Lily Y. Jan（叶公杼）教授
1997.1- 2002.4 美国哥伦比亚大学，生物学系，助理教授
2002.4- 2009.5 美国哥伦比亚大学，生物学系，副教授
2009.6- 至今 美国哥伦比亚大学，生物学系，教授
2011.7- 至今 中国科学院昆明动物所客座研究员

研究方向
神经生物学和生物物理，主要从事电压门控钙通道 (VGCC)和瞬时感受器电位(TRp)通道的综合研究，采用包括分子生物学、生物化学、细胞生物学、膜片钳、X-射线晶体学、光学影像等多种手段对这两大类离子通道的结构（包括三维晶体结构）、功能和调控进行系统的研究，在分子水平、细胞水平、动物水平解析由于这些通道基因突变或功能失常造成的人类疾病（如包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病、癫痫、自闭症、侏儒症、多囊肾等）的发病机理，应用荧光检测和全自动膜片钳等高通量筛选技术研发以这些通道为靶点的活性分子和药物。

原文摘要：

Structural basis of dual Ca2+/pH regulation of the endolysosomal TRpML1 channel

The activities of organellar ion channels are often regulated by Ca2+ and H+, which are present in high concentrations in many organelles. Here we report a structural element critical for dual Ca2+/pH regulation of TRpML1, a Ca2+-release channel crucial for endolysosomal function. TRpML1 mutations cause mucolipidosis type IV (MLIV), a severe lysosomal storage disorder characterized by neurodegeneration, mental retardation and blindness. We obtained crystal structures of the 213-residue luminal domain of human TRpML1 containing three missense MLIV-causing mutations. This domain forms a tetramer with a highly electronegative central pore formed by a novel luminal pore loop. Cysteine cross-linking and cryo-EM analyses confirmed that this architecture occurs in the full-length channel. Structure–function studies demonstrated that Ca2+ and H+ interact with the luminal pore and exert physiologically important regulation. The MLIV-causing mutations disrupt the luminal-domain structure and cause TRpML1 mislocalization. Our study reveals the structural underpinnings of TRpML1"s regulation, assembly and pathogenesis.