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血友病乙是由凝血因子Ⅸ(Factor Ⅸ,FⅨ)缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病,为伴X染色体隐性遗传病。小鼠模型对于血友病乙的研究具有十分重要的意义,而基因组编辑技术又为小鼠模型的构建提供了一种快捷而且高效的途径。

来自复旦大学生命科学学院,遗传工程国家重点实验室等处的研究人员通过CRISpR/Cas9技术进行FⅨ基因敲除，快速、高效地构建血友病乙模型小鼠，以期为血友病乙的研究提供更加便捷的途径。

血友病乙是由凝血因子Ⅸ(Factor Ⅸ，FⅨ)缺乏或功能缺陷所引起的一种常见的伴X染色体隐性遗传病。在中国人群中，男性的发病率约为1/25000。该病的临床特征是凝血功能障碍导致自发出血不止，或者凝血时间过长。目前，治疗血友病乙的唯一有效疗法为替代疗法，即使用浓缩血浆、重组人凝血因子Ⅸ制剂、凝血酶原复合物进行输血治疗。

随着病毒灭活技术的不断改进和重组蛋白的表达，替代疗法的安全性得到了保障。但由于FⅨ的半衰期短及反复输血导致患者的血管硬化等并发症，同时2%~4%的患者还会产生FⅨ抑制物，限制了替代治疗的有效性。只有基因治疗才能根治遗传病，而通过构建小鼠模型来模拟人类疾病也成为深入研究和模拟基因治疗的有效途径。传统的小鼠模型构建过程繁琐，通常将含有突变型目的基因的质粒转入小鼠的胚胎干细胞(Embryo stem cells，ES cells)中，利用自发同源重组进行基因的置换，再将胚胎干细胞与受精卵融合后进行纯合突变小鼠的筛选。该方法不仅效率低，而且筛选纯合小鼠过程耗时长，一般需要1年的时间才能得到疾病模型小鼠。此外，该方法无法实现精确位点的改造。

Ⅱ型CRISpR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/Cas9)系统是近几年发展极快的一种基因组编辑技术。该技术由一条短的单导向RNA(Single-guide RNA, sgRNA)引导Cas9核酸酶在靶标DNA位置上进行精确的识别，造成DNA断裂并诱发细胞内DNA损伤修复。通过非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)的修复方式，DNA断裂位点可能剪切或者随机插入若干碱基，从而造成断裂位点的基因突变，达到基因敲除的目的；或者当同源模板存在时，通过同源重组(Homologous recombination, HR)的修复方式，对目的基因进行碱基替换或者片段的插入，实现精确修改或者基因的敲入。CRISpR/Cas9系统中的sgRNA通过碱基互补配对与DNA结合，决定了靶向的基因编辑的位置，而该系统对靶位点的唯一要求是在靶位点的3′端要具有NGG序列，即pAM(protospacer adjacent motif)区。因此根据靶位点对sgRNA进行特异性地设计，就能对基因组中的任意位点进行精确且高效地编辑，具有很高的自主性。

在这篇文章中，研究人员利用CRISpR/Cas系统,在小鼠FⅨ基因第8外显子上选择靶位点,将Cas9 mRNA和带有靶位点的sgRNA显微注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中,获得基因修饰的小鼠。利用高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting, HRM)技术进行精确基因分型,并通过测序验证,在60只小鼠中,总共有51只小鼠的靶位点发生了突变,突变率高达85%,其中雄鼠的突变率为79.5%,雌鼠的突变率为95.2%;未检测到非目标位置的基因编辑脱靶。凝血活性实验显示,突变小鼠的FⅨ活性值(Factor Ⅸ coagulant activity, FⅨ: C)是非突变小鼠的6.82%,大大低于非突变小鼠,表明突变小鼠的凝血活性缺失。这一研究表明,利用CRISpR/Cas系统成功构建了人类血友病乙遗传病小鼠模型。

以往构建基因缺陷小鼠模型的方法是在小鼠的受精卵中显微注射凝血因子Ⅸ大片段敲除的质粒，通过同源重组的方法来获得基因敲除小鼠，但是效率只有5%，并且通过大片段敲除导致的基因缺失与人类血友病乙的基因突变类型为单碱基或者小片段突变的基因突变类型不同，因此无法精确地模拟人类血友病B疾病的基因型。

这项研究利用CRISpR/Cas9系统能够高效地将特异性靶位点的DNA双链打断，通过NHEJ修复方式，在断裂处随机引入碱基的缺失或者插入，使基因产生移码突变。但为了更好地模拟在外显子序列中由错义突变引起的人类遗传疾病，例如大部分人类血友病B的基因型，理论上可以显微共注射DNA同源模板，即利用HR方法，更加精确地构建特定基因型的小鼠模型。对基因治疗来说，同样也是利用HR的修复方式，将错误的序列替换为正常序列。

这篇文章也成功地对血友病乙小鼠在受精卵水平上进行了初步的基因纠正。但是，目前HR的修复方式相比NHEJ的修复方式效率要低，因此对于如何提高HR的效率研究也具有十分重要的意义。另外，在CRISpR/Cas9系统应用中脱靶效应是人们所关注的重点之一。研
究发现通过对Cas9核酸酶蛋白的切割域进行突变，利用修饰型的Cas9核酸酶可以使DNA双链的其中一条链断裂，从而大大降低脱靶效应的产生。

研究通过CRISpR/Cas9系统成功构建了血友病乙小鼠模型，未来将会利用CRISpR/Cas9系统构建精确碱基修改的突变类型的血友病乙小鼠模型，以及利用CRISpR/Cas9系统在生殖细胞和体细胞水平对所构建的血友病乙小鼠进行基因修复。

（生物通）

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原文检索：

汪启翰,怀聪,孙瑞林,庄华,陈红岩,费俭,卢大儒. 利用CRISpR/Cas系统快速高效构建血友病乙小鼠模型[J]. 遗传, 2015, 37(11): 1143-1148.
Qihan Wang,Cong Huai,Ruilin Sun,Hua Zhuang,Hongyan Chen,Jian Fei,Daru Lu. A quick and efficient method to generate hemophilia B mouse models by the CRISpR/Cas system. HEREDITAS(Beijing), 2015, 37(11): 1143-1148.