蜱源启动子鉴定和蜱细胞系转染体系研究新进展

2022年1月，病毒学国家重点实验室邓菲/沈姝团队与英国利物浦大学蜱细胞库合作，在Ticks and tick-borne diseases杂志发表题为“Differential characteristics of mammalian and tick-derived promoters to trigger protein expression in transfected tick cell lines” 的论文，解析了利用质粒转染方法在两种蜱细胞系表达外源蛋白的特性，比较分析了哺乳动物细胞系适用的商品化启动子和4种蜱源启动子在蜱细胞中驱动外源蛋白表达的效率，以及不同转染试剂对该方法的影响。研究成果为利用蜱细胞系开展蜱传病毒病原学以及与蜱互作机制的研究奠定重要的技术基础。

我国多种与人类和动物疾病相关的蜱传病毒，如蜱传脑炎病毒（TBEV）、克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV），发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）、以及对猪高致病性的非洲猪瘟病毒（ASFV）等的流行，严重威胁人口健康，给畜牧产业带来严重经济损失。研究蜱传病毒的生物学特性及其在媒介蜱种中的感染复制特性，将有助于深入理解蜱传病毒潜在的传播感染风险，对干预病毒在蜱中进行有效的感染复制有重要意义。为了解析蜱传病毒在蜱中的感染复制特性以及与蜱之间的蛋白分子互作，十分有必要利用蜱类细胞系建立体外研究模型，对开展病毒与蜱互作的初步的探索性研究，鉴定与病毒感染复制关联的关键蜱类蛋白/因子提供必要的技术手段。

目前，通过质粒转染人/哺乳动物细胞系是研究外源蛋白与宿主细胞互作中被广泛运用的实验手段，已经形成了如巨细胞病毒（CMV）、猿猴病毒（SV40）、单纯性疱疹病毒（HSV）等病毒来源的商品化启动子、动物来源启动子如鸡β-肌动蛋白启动子（CAG），以及人来源启动子如人磷酸甘油酸酯激酶启动子（pGK）。而蜱细胞系因其种类不多，基因组功能注释有限，对蜱细胞系的质粒转染和外源蛋白表达的方法和效率研究还比较有限。建立针对蜱细胞系的质粒转染方法并高效驱动外源蛋白表达，对开展蜱传病毒与蜱细胞关键蛋白和因子的互作机制研究，解析病毒在蜱细胞中的感染复制机制有重要意义。

该研究通过分析肩突硬蜱细胞系IED8的转录谱，选取高表达基因上游序列作为可能的蜱来源候选启动子，克隆至荧光素酶报告质粒并转染到蜱细胞中，通过检测细胞中荧光素酶的活性最终筛选到4个具有启动子活性的启动子（pro3、pro5、pro8、pro12）（图1）。研究还比较分析了哺乳动物细胞系转染中常用的商品化启动子CMV、pKG和CAG在蜱细胞系IDE8（肩突硬蜱）中的效率，结果表明CAG启动子驱动荧光蛋白表达效率显著高于CMV、pKG启动子以及4个蜱细胞来源的启动子（图2）；还发现在蜱细胞中，哺乳动物细胞系适用的启动子驱动外源蛋白表达水平在第3天达到峰值，而蜱源启动子驱动外源蛋白表达水平在转染后的第2天达到峰值，提示哺乳动物细胞系适用的启动子与蜱源启动子驱动蛋白表达时相有明显差异。该研究还比较分析了3种利用不同机制将外源核酸转染进入细胞的商品化试剂对蜱细胞系转染质粒表达外源蛋白效率的影响，表明一种与DNA浓缩增强剂联合作用的非脂质体转染试剂（Effectene with Enhancer）对蜱细胞的转染效率优于其他试剂。本研究结果为利用蜱细胞系开展蜱源蛋白功能研究，蜱细胞基因改造，解析病毒与蜱蛋白互作机制和关系等相关实验涉及的重要技术手段提供必要参考。

武汉病毒所/国家病毒资源库博士后史君明为论文第一作者，沈姝青年研究员为通讯作者。该研究得到了中国科学院生物资源能力建设项目（KFJ-BRp-017-74、KFJ-BRp-017-06）、国家重点研发计划（2019YFC1200701），英国生物技术与生物科学研究理事会项目（BB/p024270/1）的支持。

全文链接：https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2022.101906

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