Nanodrop One火眼金睛系列之——核酸中的蛋白污染鉴定

苯酚-氯仿法是核酸提取的经典方法，却极易在回收水相中的核酸时引入蛋白污染。这将导致：1）A260读数偏高，计算核酸浓度偏大；2）260/280纯度比值降低（蛋白中色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸的二硫键在280nm处有吸收）；3）污染蛋白通过干扰酶反应，影响下游的RT-pCR及qpCR结果。

Thermo Fisher公司的NanoDrop One超微量分光光度计，内置基于参考光谱数据库，结合独特的算法开发的Acclaro软件，能够准确识别、鉴定出待测样品中的污染物质，并实时给出校正后样品真实浓度。以dsDNA 和RNA 样品为例，能够鉴定出其中的蛋白、苯酚和胍盐等污染。在上次的文章中，我们分享了NanoDrop One如何准确鉴定核酸中的苯酚污染，今天我们为大家进一步解析蛋白污染对核酸样品纯度、定量的影响，以及NanoDrop One是如何准确识别此类污染，并给与准确校正的。

将dsDNA标准品（鲑鱼精子DNA溶液）和蛋白样品（BSA溶液）按照不同比例混合得到九组混合物（见表1），使用NanoDrop One分别测量其dsDNA浓度，该实验重复五次（结果见表2）。

表1 不同量的DNA 和蛋白原液混合比例

表2 NanoDrop One 测量混合物中DNA浓度

表2中，The original （uncorrected） DNA 浓度是NanoDrop One直接测出的数据，The corrected DNA浓度（混合物5–9 ）是NanoDrop One Acclaro软件分析并校正后的数据（注：混合物1-4由于污染蛋白浓度过低，不足以触发Acclaro软件的分析校正功能，因此使用Thermo Scientific™ TQ Analyst™ software package来做光谱分析完成数据校正。）

观察该表中original DNA浓度数值及纯度比值，可以看出蛋白污染对核酸样品浓度的影响规律：

1）不同程度的蛋白污染，都会导致核酸浓度虚高。且污染蛋白含量越高，核酸的测量值和真实值偏差越大。
2）足够高的蛋白含量才能够引起260/280纯度比值的显著变化。本例中污染蛋白比例占到近72%时，A260/A280纯度比值为1.74，仍处于可接受范围内。当污染水平从72%增加到98%时，A260/A280纯度比值才从1.74稳步降至0.89.

同时，从该表中corrected DNA浓度以及黄色警示标识表示可以看出NanoDrop One的污染物校正功能特点：

1）能够准确识别并且定量核酸样品中的蛋白污染，超出一般实验可接受范围时给与警示符号提示。
2）使用Acclaro软件，校正后的核酸浓度与真实值的偏差控制在10%范围内。即使对于98%的极端蛋白污染浓度，Acclaro给出的校准值依然在此范围内，且具有高度可重复性。

表3 所有混合物的校正浓度均在实际DNA浓度的10％以内