2020年3月11日，国际知名期刊Science Advances在线发表了西北大学王朝晖团队和上海交通大学陶生策团队合作开展的最新研究成果：An Array of 60,000 Antibodies for proteome-Scale Antibody Generation and Target Discovery。


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抗体作为一类重要的生物亲和试剂，在生命科学研究和医学相关研究中不可或缺。在高通量核酸测序技术的强大测序能力的推动下，目前已有大量物种的基因组被完全测序。针对这些物种，需要大量的抗体来推动后续研究。但常规抗体制备技术费时，费力且耗费不菲，一般一次只能制备一种抗体，无法满足在较短的时间内获得大量抗体的迫切需求。针对上述需求，本文作者研究开发了一款包含62,208种单克隆抗体的超高通量抗体芯片，并利用抗体的多特异性（multi-specificity）去发现和寻找新抗体。

该芯片被成功验证可用于快速蛋白抗体制备、蛋白质组水平的抗体组制备、表型相关蛋白质筛选以及肿瘤药物靶向蛋白的发现等多种不同目的应用。这些单克隆抗体的免疫原来自400+类物种的3,000+种蛋白质的15,000+个线性表位，通过上万只小鼠的免疫、骨髓瘤细胞融合和筛选，最终形成了一个具有高度多样性，包含62,208种单克隆抗体的超大容量抗体库（图一）。


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图1. pETAL抗体库的构建过程

实验中研究人员为了证明抗体芯片的广泛应用性，首先用81个人与大肠杆菌随机来源的蛋白对pETAL芯片进行了筛选，证明了pETAL可以在较短的时间内（1-2周）以至少20%的成功率获得随机蛋白的高亲和力识别抗体。这也意味着对类似人这样含1万种以上蛋白的蛋白质组，pETAL有可能实现几千种蛋白的识别覆盖。为验证pETAL在蛋白组抗体开发上的可能性，研究人员提取几种人细胞系的膜蛋白组和核蛋白组，批量地筛选得到了149个膜蛋白单抗和55个核蛋白单抗，随后对这些抗体进行了严格的特异性评估并且证明筛选得到的单抗可适用于IF、ChIp-seq等多种应用（图2）。同时，研究人员也已经在超过10个物种（涵盖了病毒、细菌、真菌、植物、动物）上成功验证了pETAL可用于批量开发这些物种特异的应用抗体，因而pETAL有望为目前缺少抗体研究工具的多个物种提供一个批量抗体开发的解决方案。


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图2. 规模化抗体组的制备和抗体质量评估

pETAL在蛋白组抗体开发应用上成功也进而指出了pETAL可应用于物种表型/功能相关的蛋白与抗体发现，通过比较特定表型与对照之间的芯片信号差异以获得抗体，并采用相同的方法鉴定抗原。研究人员以“玉米籽粒发育”和“斑马鱼心脏再生”为代表成功地鉴定了19个与玉米发育相关的蛋白质，以及6个与斑马鱼心脏损伤相关（图3）的蛋白质。这种技术的优势在于可在鉴定到关键蛋白的同时获得高质量的单克隆抗体，用以后续的验证和功能实验。


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图3. pETAL应用于发现斑马鱼心脏再生相关的特异表达蛋白

最后，研究人员利用该抗体芯片技术，证明了pETAL技术在肿瘤治疗标靶发现和抗体先导药物研究中具有重大的应用潜力。研究人员应用pETAL芯片对肺癌组织和癌旁组织的膜蛋白进行差异筛选，通过对所获得的肿瘤组织特异表达阳性抗体进行肿瘤细胞内吞和毒性实验等功能验证，最终获得4个具有肿瘤特异杀伤作用的抗体，并鉴定了其靶标蛋白。其中，针对人肿瘤标志物CD44v9的单抗pb44707（AMT707）进行了细胞水平和小鼠模型等多层面的肿瘤抑制验证，发现该抗体具有较好的抗肿瘤药物潜力（图4）。


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图4.特异识别CD44v9的抗体AMT707在药物偶联后具有良好的肿瘤生长抑制作用

综上所述，该研究所开发的超高通量抗体芯片及所建立的方法在概念是一种突破，充分地利用了抗体的多特异性来发现新的抗体，以前虽有零星的相关研究，但只有本研究第一次提供了一个可行的实现途径。论文的作者之一上海交通大学陶生策教授表示：“抗体芯片技术过去一直有相关研究和应用，但之前的抗体芯片一般最多包含有约1000多种抗体，本研究中开发的抗体芯片上包含的抗体数目是其60多倍，使得抗体芯片技术应用的广度和深度实现了巨大的进步。”

本文的另一位作者，西北大学/Abmart公司王朝晖博士表示：“抗体是生物学和医学研究中必不可少的工具，如何能够高效率、低成本的开发抗体一直是抗体开发人员技术追求。通过超大容量抗体芯片技术，他希望能够让抗体开发不再成为科研人员的负担。”同时王朝晖博士也提到“近年来，各种形式的抗体药物成为了医药领域的最大热点。也希望通过抗体芯片技术，在新药靶点的筛选筛选方面和抗体药物先导分子的开发中发挥效率优势。”项目研究团队将开放抗体芯片技术平台给全球的科研工作者，合作方式如图5所示。


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图5.pETAL作为开放资源，提供灵活的合作方式

本项研究涵盖了从基础科学研究到临床和制药研究等多方面的研究数据，联合了包括西北大学、上海艾比玛特公司、上海交通大学、武汉大学、西南大学、中国科学院、中国农科院、中国农业大学、郑州果树所、广西农科院、华南农业大学、中日友好医院，以及美国杜克大学等十多家中外研究机构。本研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划以及西北大学特聘教授基金等的资助。

全文链接：https://advances.sciencemag.org/content/6/11/eaax2271