赛默飞的儿童疾病研究和精准基因诊断整体解决方案

Theromo Fisher Scientific（赛默飞世尔科技公司）是2016年全球领先的科学仪器生产商，旗下拥有一代测序和荧光定量pCR技术的业内顶级品牌applied biosystems、二代测序技术的业内顶级品牌Ion Torrent、基因芯片技术的业内顶级品牌Affymetrix等。

我们能够提供儿童疾病分子检测从样品到结果的完整产品解决方案。

一、高通量测序技术（二代测序）在儿童疾病相关分子检测中的研究和临床应用

1、技术定位

高通量测序适合用于多基因或多位点相关的疾病的分子诊断，包括已知变异/病因的检测和未知变异/病因的筛查。如复旦大学附属儿童医院基于高通量测序技术已开展了新生常见畸形筛查、糖原累积病、性腺发育不全、生殖障碍、儿童罕见病、苯丙酮尿症、儿童肿瘤等。

2、推荐产品——Ion S5高通量测序系统（2015年最新产品）

3、可开展的临床项目或研究——遗传病、罕见病、血液病、发育和代谢疾病等分子检测

我们提供业内最多、种类最全的遗传病风险检测/研究的高通量测序试剂盒解决方案，涵盖代谢系统、神经系统、免疫系统、血液系统、耳聋/听力损失、智力/发育等相关疾病。

同时，我们也支持自由定制（Ion AmpliSeq Designer）panel，满足不同医院对各种疾病分子检测的个性化需求。

例如：下面是客户定制的涵盖5种常见儿童遗传病的panel信息及其检测结果和报告。

适用人群：新生儿，孕早期胎儿（羊水），有病史或家族史；人群综合携带率约大于10%，人群综合患病率大于1%，综合检出率大于80%。

疾病名称

（发病率）

检测基因

外显子、突变位点

新生儿检测意义

地中海贫血

(α型、β型)

（1%-16% 不同地区）

HBA1、HBA2、HBB

症状发生前预防并治疗可有效减少并发症，如发育不良，智力迟钝等，同时检测出αβ复合性地贫可避免错误治疗带来的伤害的

血友病

(A型、B型）

1/5000 新生儿

F8、F9

尽早发现并分型，以进行症状前治疗，减少抑制物产生概率，提高疗效减少支出，可使寿命达到正常人水平；对于中型尽早发现可预防关节畸形，轻型患者难以确诊，可能在手术时出现大出血才诊断，这会带来很大的意外危害

苯丙酮尿症

1/10000

pAH

出生早期时发病前发现并及时治疗可不造成任何伤害，否则在发病后会产生不可逆的智力损伤

成人多囊肾

1/200~1/1000

pKD1、pKD2

提前预防并发症，减少痛苦和支出，延长寿命；新生儿携带者的检出可以有效预防其在青年病发前生出致病的孩子，而使疾病代代相传

遗传性耳聋

1/1000

COL11A2，SLC26A4，

GJB2, GJB3，GJB6, 12S

避免药物过敏性耳聋和震荡性耳聋

下面为5种遗传病panel检测结果和报告

4、客户开展的项目举例

（1）复旦大学附属儿童医院

客户基于我们的高通量测序在线panel定制工具（（Ion AmpliSeq Designer），定制了多个与儿童遗传病、发育、代谢、肿瘤相关的检测panel。

（注：截图来自客户公开报告ppT）

（2）武汉同济医院

（注：截图来自客户公开报告ppT）

（3）郑州大学第一附属医院

开展的遗传病检测项目包括：苯丙酮尿症、甲基丙二酸血症、白化病、杜氏\贝氏肌营养不良、血友病、肝豆状核变性、神经纤维瘤、大疱性表皮松懈症、尼曼匹克血症、范可尼贫血、多发性骨软骨瘤、神经纤维瘤、多囊肾、结节性硬化、X连锁无丙种球蛋白血症、遗传性球形红细胞增多症、白内障、视网膜色素变性等。

除了以上单位外，我们很多其他客户也在开展基于高通量测序技术进行儿童疾病相关的分子检测。例如：上海儿童医学中心、新华医院、上海儿童医院、北京儿研所、江苏省人民医院、苏州儿童医院、武汉市儿童医院等、北京儿童医院。

5、国内客户发表的文章举例

1. A functional variant in ApOA5/A4/C3/A1 gene cluster contributes to elevated triglycerides and severity of CAD by interfering with microRNA 3201 binding efficiency

通讯作者：汪道文（武汉同济医院）
发表杂志：J Am Coll Cardiol, 2014, 64: 267-277 影响因子：17.759
内容简介：利用一代测序、二代测序和荧光定量pCR技术研究ApOA5/A4/C3/A1基因簇多态性能影响甘油三酸酯（TG）水平及冠状动脉疾病（CAD）的分子机制

2. 文献参见下图介绍（pLOS ONE影响因子3.057）

3. NGS-based 100-gene panel of hypopigmentation identifies mutations in Chinese Hermansky–pudlak syndrome patients

通讯作者：李巍（北京儿童医院）
发表杂志：pigment Cell and Melanoma Research. 2016, 29:702-706影响因子：4.163
内容介绍：Hermansky-pudlak综合征(HpS)是具有色素缺失表现并伴有出血倾向等表型的一类遗传性疾病，与多种溶酶体相关细胞器(LRO)的缺陷有关。目前已确定的HpS亚型有10种，包括HpS1-HpS10基因突变。在中国人群中仅报道过4例HpS-1的病人。在本研究中，我们利用二代测序技术(NGS)，对具有典型眼皮肤白化病表型以及血小板致密颗粒缺失表型的中国HpS病人，选择100个与色素减退有关的基因进行了检测，鉴定出4例HpS-1突变、2例HpS-3突变、1例HpS-5突变和3例HpS-6突变。在这些病人中，1例为纯合突变，其余均为复合杂合突变。在这些基因突变中，有14个突变位点是之前未见报道的(其中，HpS1基因有4个、HpS3基因有3个、HpS5基因有2个、HpS6基因有5个)。本研究结果证明了二代测序在HpS诊断中是非常实用和有效的。而对于HpS亚型的基因型分型，是对各亚型特异性症状的个体化治疗的先决条件。

二、基因芯片技术在儿童疾病相关分子检测中的应用

1、技术定位

基因芯片适合用于多基因或多位点相关的疾病的分子诊断，特别适合染色体数目或结构异常相关疾病的检测。例如：与染色体异常相关的先天性疾病（如儿童发育迟缓或智力障碍等），非已知综合征的多发畸形；自闭症谱系障碍，以及染色体结果异常（缺失与重复）的检测等。

2、推荐产品——Affymetrix GeneChip® System (GCS) 3000Dx v.2 (Dx2)基因芯片系统

GeneChip® System (GCS) 3000Dx v.2是临床研究最可靠的基因芯片平台，也是唯一一款经美国FDA和中国CFDA批准、带有欧洲CE–IVD认证的芯片系统，适合基于RNA和DNA的临床检测，全面支持基因芯片的各种应用，包括基因表达、基因分型、细胞遗传学、表观遗传学、拷贝数变异、再测序和Tiling等。

该基因芯片系统包括杂交仪、洗涤工作站、扫描仪和计算机工作站等四个部分，可自动完成Affymetrix所有卡式芯片的杂交、洗涤、扫描及初步数据分析。

3、可开展的临床项目或研究——遗传病、发育异常、血液病、耳聋疾病等分子检测

基因芯片技术可在全基因组范围内检测到染色体的缺失和增加并能准确地测定其大小；可同时检测多种因染色体失衡而导致的疾病（比如杂合性缺失（LOH）、单亲二倍体（UpD））；可检测到≥20%水平的嵌合体；并且分辨率高，可以确定50kb的重复（gain)及25kb的缺失（loss)，相比传统核型分析高出近千倍。

多个国家的行业协会，例如：美国遗传学协会（ACOG）、国际细胞芯片标准委员会（ISCA）等均推荐将基因芯片技术用于儿童遗传病的诊断和研究。2010年，加拿大遗传协会（CCMG）推荐芯片技术用于以下产后指征：原发性智力低下/生长发育迟缓/自闭症/多发性先天畸形；新突发明显的染色体平衡异位或遗传自表型正常的亲代；不孕或反复自然流产夫妇。儿科学杂志（pediatrics）2010年4月刊推荐芯片技术作为孤独症首选诊断技术。

2016年6月的《中华儿科杂志》也发表了《染色体基因组芯片在儿科遗传病的临床应用专家共识》，明确指出：染色体微阵列/CMA/基因芯片可作为一线检测手段用于：（1）不明原因的智力落后和（或）发育迟缓。（2）非已知综合征的多发畸形。（2）自闭症谱系障碍。

Affymetrix CytoScan HD芯片系统拥有业内最高的探针密度、基因覆盖度（见下表）、分辨率和性能表现。其同款产品Affymetrix CytoScan Dx Assay被FDA批准，用于与染色体异常相关的先天性疾病（如儿童发育迟缓或智力障碍等）的检测，用于染色体结果异常（缺失与重复）的检测。

配合全球唯一的通过中国CFDA/美国FDA/欧盟CE-IVD认证的基因芯片扫描系统GCS 3000Dx v.2，Affymetrix CytoScan HD和750K芯片被广泛的用于儿童遗传病临床诊断。

percentage of genes covered

(25 markers/100 kb)

CytoScan HD

CytoScan 750K

ISCA constitutional genes (340)

国际遗传学芯片标准协会基因库

100%

Cancer genes (526) 癌症基因

100%

OMIM Morbid genes (2,640) 孟德尔遗传病基因库

98%

83%

X chromosome OMIM Morbid genes (177) X染色体

100%

93%

RefSeq genes (36,121)

96%

80%

下表是上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心利用CytoScan HD等基因芯片开展的500例儿童不明原因智力落后的检测结果。

4、客户发表的文章举例

1. Discovery of a previously unrecognized microdeletion syndrome of 16p11.2–p12.2

通讯作者：Lisa G Shaffer（华盛顿州立大学）
发表杂志：Nature Genetics, 2007, 39: 1071-1073 影响因子：31.616
内容简介：通过基因芯片等技术在4个发育障碍的患者身上发现一个新的在着丝粒区域的微缺失综合征

2. Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma

通讯作者：William O. C. Cookson（英国帝国理工学院）
发表杂志：Nature. 2007, 448: 470-473 影响因子：38.138
内容简介：通过基因芯片等技术研究基因突变对与儿童哮喘相关基因表达的影响

3. Smaller and larger deletions of the Williams Beuren syndrome region implicate genes involved in mild facial phenotype, epilepsy and autistic traits

通讯作者：Giuseppe Merla（IRCCS Casa Sollievo Della Sofferenza 医院，意大利）
发表杂志：European Journal of Human Genetics, 2014, 2: 64–70 影响因子：4.58
内容简介：通过基因芯片等技术鉴定Williams Beuren综合征区域的大小缺失，可发现与轻度面部表型的癫痫和自闭症特征相关的基因

5、国内儿童医院/儿科相关Affymetrix基因芯片客户

上海儿童医学中心，上海市新华医院，中国人民解放军总医院，国家计生委科研所，博奥公司，山西计生委，西京医院，郑州大学第三附属医院，成都市妇幼保健院，华西医院，重庆儿童医院，广州市妇女儿童医疗中心，中山医科大学第一附属医院，中山大学附属第二医院，金域医学检验中心，深圳计划生育研究院，南京鼓楼医院，浙江省妇幼保健院，嘉兴市妇幼，上海市第一妇婴保健院，济南市妇幼保健院，青岛市妇女儿童医院，武汉康圣达医学检验所等。

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三、毛细管电泳基因分析技术在儿童相关分子检测中的应用

1、技术定位

毛细管电泳基因分析平台适合用于单基因或少量已知位点（<30）相关的疾病的分子诊断，如单基因遗传病，以及亲子鉴定。

2、推荐产品——Applied Biosystems 3500Dx或3500xL Dx基因分析仪

Applied Biosystems的毛细管电泳平台——基因分析仪是毛细管电泳基因分析的行业标准，是业内最可靠、高效和发表文献最多的DNA序列分析技术。Applied Biosystems 3500Dx和3500xL Dx基因分析仪是经过CFDA认证的最新产品，分别支持8道（可升级24道）和24道检测通量。

3、可开展的临床项目或研究——单基因遗传病、亲子鉴定等分子检测

3500基因分析平台能够运行多种类型的应用，包括新基因测序和重测序（突变图谱），以及微卫星分析、MLpA、LOH、ApLp、MLST和SNp的验证和筛选。与儿童相关的应用项目主要是单基因遗传病和亲子鉴定。

单基因遗传病目前已发现7000余种，某些单基因病是不可治愈并严重影响患儿生活质量的出生缺陷，不仅影响到儿童生命健康与生活质量，降低出生人口的素质，更是深深影响到家庭的幸福和谐。单基因遗传病适用于因单个基因异常而导致的以孟德尔方式遗传的疾病，包括常染色体显性、隐性遗传，性染色体显性、隐性遗传病。理论上只要有足够的序列信息，有明确的基因诊断，基因诊断能针对任何遗传病进行。

举例1、苯丙酮尿症基因检测

疾病概述

▪98%的患儿因苯丙氨酸羧化酶基因pAH突变，无法将苯丙氨酸转化为酪氨酸
▪pAH基因位于12号染色体q24.1区域，1.5Mb，包含13个外显子
▪已经发现440多种pAH致病性突变，国内30余种
▪突变未知多变，涉及区域广泛；突变类型多样

临床意义

▪苯丙酮尿症是少数可以治疗的遗传病之一，早期诊断是决定苯丙酮尿症预后的关键
▪出生后1个月内接受治疗者多数可能不出现智力损害，治疗越晚，对脑的损伤越明显。因此，患儿一旦确诊，应立即给予治疗，治疗越早，预后越好。
▪对苯丙氨酸羧化酶（pAH）基因3,6,7,11,12外显子进行测序鉴定突变是诊断的最佳方案（下图为测序结果分析示意图）

举例2、基于一代测序MLpA技术的杜氏肌营养不良（DMD）的基因检测

MLpA技术

多重连接依赖探针扩增（Multiplex Ligation-dependent probe Amplification，MLpA）采用多重pCR的方式进行核酸样品检测，能够在一个简单的反应内检测多达50个特异核酸序列的拷贝数变化，因此能够检测大量基因的缺失和重复突变。MLpA已被公认为一种可靠有效的方法，自2002年首次报道以来，已在全球900多家实验室使用，广泛应用于拷贝数变异所致疾病的基因诊断。

疾病概述

杜氏肌营养不良（DMD）和贝氏肌营养不良（BMD）是由编码肌营养不良蛋白（dystrophin）的DMD基因突变引起。该基因是目前发现的人类最大的基因，长2.4Mb，含80个外显子，其主要突变类型为外显子缺失，占全部突变的50~70%，点突变约占25%，重复突变约占5~10%，突变位置无固定规律。由于DMD基因结构复杂，突变形式多样，临床检测难度很大。MLpA p034/p035试剂盒用于检测DNA样品中DMD基因一个或数个外显子的缺失或重复。在男性患者样品中，X染色体上某一外显子的缺失会导致相应探针信号完全消失，但在女性携带者样品中只会产生35~50%的峰面积降低。

亲子鉴定就是运用现代医学和生物学技术，检测对比父母与子女间的遗传标记进行亲生关系的鉴定。ThermoFisher的一代测序/基因分析仪是全球第一品牌，广泛用于亲子鉴定检测。ThermoFisher能够提供亲子鉴定所需的全套试剂、仪器和软件。新一代法医鉴定及亲子鉴定试剂盒AmpFlSTR Identifiler pCR扩增试剂盒是一个多重短串联重复序列（STR）检测试剂盒。它采用最新的五色荧光、一个泳道技术，可以同时扩增和同时检测16个STR位点（15个4核苷酸重复位点加上Amelogenin性别判定标记）。可以用于个人亲子鉴定，司法亲子鉴定，宫内亲子鉴定，亲缘鉴定，个体识别等。

4、客户开展的项目举例

（1）武汉同济医院

（2）中信湘雅生殖与遗传专科医院

（3）广州医科大学附属第三医院

5、国内客户发表的文章举例

1. Clinical phenotypes and Genotypic Spectrum of Cystic Fibrosis in Chinese Children

通讯作者：赵顺英（北京儿童医院）
发表杂志：Journal of pediatrics. 2016, 171:269-276 影响因子：3.89
内容介绍：背景：囊性纤维化(CF)是高加索人群中最常见的遗传性疾病，此病已被证实与CFTR的基因突变有关。然而，囊性纤维化在中国人群中相当罕见，至今仅有极少量的CF病例被报道。方法：分析21例确诊囊性纤维化的中国儿童的临床表型及基因型。结果：(1)支气管扩张(95.2%)以及鼻窦炎(76.2%)为最主要的临床特征，而胰腺外分泌功能不全却很罕见(14.3%)。气道最主要的致病病原为铜绿假单胞菌(66.7%)。CF的儿童存在显著的肺功能低下FEV1 (71.8±17.2%预计值)，FEF75 (33.7±20.4%预计值)。(2)通过基因测序比对，我们发现了22种不同的CFTR基因突变，包括12种错义突变，5种无义突变，2种框移突变，1种非移码插入，1种剪切位点突变，1种3"UTR区突变。其中，有7种突变为新发突变(W216X[780G→A], 1092insA, Q359X, D567Y, 2623-126T→C, 3439delA , 4575+110C→G)。中国儿童中最常见的突变类型为L88X和I556V，所有的突变类型均非高加索人CFTR的常见突变。结论：囊性纤维化在中国儿童中普遍存在漏诊现象，可能归因于对疾病的认识不足以及诊断方法的局限。中国儿童囊性纤维化的表型和基因型与高加索人相比存在很大的差异。

2. Evolutionary History and Ongoing Transmission of phylogenetic Sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype in China

通讯作者：申阿东，万康林，Igor Mokrousov（北京儿童医院，中国疾控中心，圣彼得堡巴斯德研究所）
发表杂志：Scientific Reports. 2016, 6:34353 影响因子：5.228
内容介绍：北京基因型结核分枝杆菌起源于中国，并在上个世纪广泛传播于全球。本文通过采用24-位点MIRU-VNTR分型法和现代株-古代株分型法将来自中国多个省市的北京基因型结核分枝杆菌菌株进行基因分型，总结不同基因型菌株的分子特征、地域差异及宿主特征，得出：空间距离仍是结核分枝杆菌群体基因异质性的决定性因素之一，不同地域来源菌株的多样性和网络拓扑结构分析数据似乎也证实了北京家族菌株来源于中国南方地区;同时，将本文结果与欧亚背景结合分析发现俄罗斯B0/W148菌株和亚/俄A0/94-32重要流行克隆株可能分别起源于中国东北部和西北部;儿童宿主来源的现代株成簇率较高，但儿童耐多药结核菌株在各亚系菌株中均无显著增高，这提示菌株成簇可能与耐药无关，而与其他能够提高我国现代菌株传播能力的特性相关，如菌株毒力因素等。

3. Compensatory Mutations of Rifampin Resistance Are Associated with Transmission of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype Strains in China

通讯作者：申阿东（北京儿童医院）
发表杂志：Antimicrob Agents Chemother. 2016, 60: 2806-2812 影响因子：4.415
内容介绍：耐药结核病，尤其是耐多药结核病(MDR-TB)的出现给结核病的防控带来了严峻的挑战。利福平(RIF)是抗结核治疗中重要的一线药物，90%以上的RIF耐药株存在rpoB突变。研究表明，rpoB突变后通常伴随有细菌的适应性下降，而rpoA和rpoC基因(分别编码RNA聚合酶α和β’亚基)上的突变可以改善这种适应性代价。目前我国RIF耐药菌株中rpoA和rpoC基因突变的情况及其在菌株传播过程中的作用并不明确。本研究收集了2011-2013年期间在北京胸科医院就诊的结核病人的临床分离株510株，包括RIF耐药菌株331株和RIF敏感菌株179株。对所有入组菌株进行VNTR-MIRU(24位点)基因分型，以及rpoB耐药核心区(RRDR)、rpoA和rpoC基因的序列测定。以了解我国北方地区结核分支杆菌(MTB)中rpoA和rpoC基因突变的情况及其在菌株传播中的作用。
结论：rpoA和rpoC基因突变在我国MTB菌株中较为流行，以rpoC突变为主，且可能与RIF耐药性的产生相关;携带rpoC基因突变的MDR菌株传播能力更强。

四、荧光定量pCR技术在儿童疾病相关分子检测中的应用

1、技术定位

荧光定量pCR适合用于单基因或少量已知位点（<20）相关的分子诊断，如传染病、单基因遗传病和药物基因组（pGx）的分子检测。

2、推荐产品——Applied Biosystems 7500Dx荧光定量pCR系统