mRNA疫苗的发展概况：第四部分

与包括SARS和中东呼吸综合征在内的其他人类冠状病毒一样，SARS-CoV-2是一种包膜、正链单链RNA病毒。它的基因组RNA编码非结构多蛋白和结构蛋白，包括刺、冠(S)，包膜(E)，膜(M)和核衣壳(N)蛋白。作为表面蛋白，S、E和M蛋白被插入病毒包膜，S糖蛋白赋予病毒颗粒一个“冠”和名称。N蛋白包围着正链基因组RNA。SARS-CoV-2利用S蛋白进入宿主细胞。

S糖蛋白全长1273个氨基酸，由N端信号肽、胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成。它在功能上分为S1和S2亚基(图1A)。受体结合域(receptor binding domain, RBD)位于S1亚基的C端，负责与人血管紧张素转换酶2 (angiotensin-convert enzyme 2, hACE2)结合。S2介导膜融合。融合前的S结构揭示了S1亚基的4个结构域，N端结构域(NTD)、RBD、c端结构域(CTD) 1和CTD2，它们围绕着S三聚体的三轴，覆盖下面的S2。片段;S2亚基似乎是一个对称的三聚体，其中第一个七肽重复序列(HR1)向病毒膜弯曲(图1B)。

融合构象中的SARS-CoV-2 S三聚体结构显示，HR1经过大量的结构重排后，与中心螺旋(CH)形成了一个异常长的中心三股螺旋线圈(图1C)。另外，有报道称SARS-CoV-2 S蛋白自发过渡到融合后状态与靶细胞无关。将全长S编码质粒转染细胞后，融合前后均产生S蛋白。

S蛋白在融合前构象中的高度不稳定性无疑是基础疫苗开发的主要障碍。幸运的是，在CH开头引入两个连续的脯氨酸残基(2p)是保持β-冠状病毒S蛋白在融合前构象的一般策略。脯氨酸主链的扭转角度有限，可能不利于CH与HR1之间的关节的再折叠，阻止S蛋白转化为融合构象。

另外，对SARS-CoV-2 S-2p突变体的低温电镜结构显示，2p取代并没有改变S蛋白的构象(图1D)。同时也报道了RBD-hACE2、RBD-单克隆抗体等多种结构。RBD包含两个结构子域，其中5条反平行b链包含一个保守的核心子域，另一个外部子域由一个灵活的环状控制，稳定了识别hACE2的二硫键(图1E)。此外，RBD和S-2p蛋白均可诱导有效的SARS-CoV-2中和抗体和T细胞应答。因此，它们作为免疫原被广泛应用于COVID-19 mRNA疫苗的开发。

图1 COVID-19 mRNA疫苗抗原

A:全长SARS-CoV-2S原色结构示意图。SS，信号肽；NTD，N-末端结构域；RBD，受体结合域；CTD，C-末端结构域；Fp，融合肽；HR1，七肽重复1；CH，中央螺旋；CD，连接器域；HR2，七肽重复2；TM，跨膜结构域；CT，细胞质尾部。B： 融合前SARS-CoV-2野生型S蛋白的结构。C： 融合后SARS-CoV-2野生型S蛋白的结构。D： SARS-CoV-2S-2p的结构。E： SARS-CoV-2RBD的结构。

该mRNA疫苗包含S蛋白编码区，两侧为优化后的5 ' -和3 ' -UTR及polyA尾，IVT合成，然后5 ' 端用5 '-cap的模拟物加帽，用LNp封装，进行IM注射(肌肉注射)(图2步骤1)。如树突状细胞或巨噬细胞，通过内吞作用(步骤2)。mRNA分子从LNp上卸下，在核糖体中翻译成S蛋白(步骤3)。新合成的S蛋白分泌到细胞外间隙，通过内吞作用内化到抗原提呈细胞中，并将抗原作为MHC II类抗原呈递复合物的一部分呈现给免疫细胞(步骤5b、6b和7)。包括T细胞和B细胞。部分降解的蛋白体S肽被整合到MHC I类复合物中，然后转运到质膜并作为抗原呈现给免疫细胞(步骤4a、4b、5a和7)。

图2 COVID-19 mRNA疫苗的递送及工作机制

凭借其多功能性和快速开发优势，两种COVID-19 mRNA疫苗(mRNA-1273和BNT162b2)已获批上市，一种候选药物正在进行III期临床试验，其他三种候选药物目前正在进行I期或II期临床评估。表1根据已发表的临床前实验或临床试验数据，列出了临床试验中所有COVID-19 mRNA疫苗或候选疫苗，并总结了其安全性、中和抗体应答和保护效果。

表1 COVID-19 mRNA疫苗的临床应用

BNT162b2是一种脂质纳米颗粒制剂，核苷修饰的mRNA疫苗，用于预防由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染引起的新冠病毒2019 (COVID-19)。BNT162b2编码的SARS-CoV-2 S蛋白的表达可诱导受体对抗原的免疫应答。BNT162b2以双剂量肌注给药。保护率可达95%。

BNT162b2需要冷藏(这是疫苗分发的后勤挑战)，在使用前必须解冻和稀释。稀释后，每瓶含有6个30μg剂量。肌肉注射BNT162b2分为两个疗程，每次30μg(理想情况下注射到三角肌内)，建议间隔21天。注射第二剂7天后，可能无法完全预防COVID-19。与其他疫苗一样，BNT162b2可能不能保护每一个接受者。

BNT162b2由核苷修饰的mRNA组成，被脂质纳米颗粒包裹，编码一个膜锚定的SARS-CoV-19全长S蛋白，并包含一个突变，使S蛋白稳定在抗原优先的预融合构象中。脂质纳米颗粒保护非复制RNA不被降解，并允许其在肌肉注射后进入宿主细胞。一旦进入宿主细胞，mRNA被翻译成SARS-CoV-2 S蛋白，在宿主细胞表面表达并诱导中和抗体和细胞免疫应答(图3)。

图3肌内注射BNT162b2的作用机制

尽管mRNA疫苗在过去几年中显示出了明显的优势，但直到SARS-CoV-2大流行显著加速和加快了临床试验和审查，人类才批准使用首个mRNA疫苗。这无疑是疫苗接种史上的一个里程碑。如果成功，基于mRNA的疫苗可能成为未来大流行的即时“标准”解决方案，但它们也可能取代一些传统的基于蛋白质的减毒活疫苗。mRNA平台也可能优于其他平台，并且可以最快地修改和分配，以对抗在大流行期间出现的新的突变病毒株。

基于mRNA疫苗平台近10年来的重大技术创新和进步，新冠肺炎mRNA疫苗以前所未有的速度成功研制成功。在临床试验中，与蛋白亚单位疫苗和灭活病毒疫苗相比，COVID-19 mRNA疫苗出现发热、乏力等全身性不良事件的发生率更高。因此，有必要对COVID-19 mRNA疫苗的安全性进行长期监测。大多数mRNA疫苗设计为产生中和性IgG抗体，中和性IgG抗体只能通过肌肉免疫有效保护下呼吸道。然而，IgA抗体可能是消毒和免疫所必需的，其主要作用是保护上呼吸道，目前的临床试验尚未确定mRNA疫苗诱导的IgA抗体水平。此外，虽然mRNA-1273研究结果显示，在首次人类疫苗接种后，高中和抗体滴度至少持续4个月，但这些mRNA疫苗能够保护人类对抗COVID-19的时间需要进一步阐明。

另一方面，仍然需要数据来评估mRNA疫苗是否适合所有人，包括儿童、老年人、免疫抑制个体以及自身免疫性疾病等慢性疾病患者。与不同药物的相容性也需要评估。mRNA疫苗诱导的I型IFN应答是否会成为各种基础疾病患者或I型IFN治疗的问题?其中一些类型的调查已经开始或正在计划中。在发放获批的SARS-CoV-2 mRNA疫苗期间，mRNA疫苗的其他问题引起了卫生保健系统的极大关注，包括冷链和存储限制。即使在高收入国家，许多诊所和接种点也不能使用低温冰箱来满足某些mRNA疫苗的需求。这一挑战在低收入国家将变得更加突出。因此，迫切需要对这些问题进行改进和验证。

自从Wolf等人证明了蛋白质可以在活体组织中从体外转录的mRNA中产生，mRNA疫苗已经在许多应用中证明了其有效性。基于RNA脉冲DC癌症疫苗的第一次使用mRNA技术的临床试验可以追溯到2003年。今天，可以发现140多个临床试验使用mRNA来处理不同的情况，如癌症或传染病(图4)。

图4每年按疾病类型(左)和给药系统(右)提交的mRNA疫苗临床试验分解图

癌症是目前mRNA技术的首选靶点。50%以上的临床试验关注治疗黑色素瘤、前列腺癌和脑癌(图5),和大多数试验仍在早期阶段(I和II)。除了安全性和免疫反应,癌症治疗的标准的缺乏阻碍了疫苗有效性的评估。然而，传染病并非如此，因为许多传统疫苗可作为验证新mRNA疫苗的基准。mRNA还显示出其他潜力，不仅用于治疗癌症，而且作为许多其他疾病(如心血管疾病和II型糖尿病)的蛋白表达的治疗剂。

图5 mRNA疫苗的应用

表2和表3总结了mRNA疫苗对癌症和感染性疾病的临床应用。

表2 mRNA疫苗抗肿瘤临床试验

表3 mRNA疫苗抗病毒性疾病的临床试验

(来源:互联网,仅供参考)