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图片:迈克尔Niederweis 阿拉巴马大学

六年前，迈克尔·尼德维斯博士描述了迄今为止发现的第一种针对致命病原体结核分枝杆菌的毒素。这种毒素，结核坏死性毒素，或称TNT，成为一种以前未被识别的新型毒素的创始成员，这种毒素存在于600多种细菌和真菌中，这是通过蛋白质序列相似性确定的。当结核分枝杆菌在宿主人体巨噬细胞中存活和生长时，毒素被释放出来，杀死巨噬细胞，让细菌逃逸和传播。

在132年的时间里，结核分枝杆菌缺乏一种确定的毒素，这与几乎所有其他的致病菌形成了鲜明的对比，这些致病菌的毒素会导致疾病或死亡。结核分枝杆菌每年感染900万人，并导致100多万人死亡。

现在，在另一项突破性的工作中，阿拉巴马大学伯明翰分校的研究人员和同事们描述了结核分枝杆菌制造的两个小ESX蛋白如何通过在包裹细菌的细胞膜上形成小孔来调节TNT的分泌。这一发现可能有广泛的应用,因为独特的three-amino酸主题上发现EsxE EsxF——/ any-amino-acid /甘氨酸,色氨酸在速记WXG——也发现许多其他小分枝杆菌蛋白质和大型WXG100总科的细菌蛋白质类似EsxE和EsxF。

“在这里，我们首次证明了WXG100家族的小Esx蛋白通过介导毒素分泌在Mtb细胞内具有重要的分子功能，”Niederweis说，他是UAB微生物学系的教授。“我们的结果表明，小Esx蛋白形成小孔的动态机制可能适用于大型WXG100蛋白家族的其他成员。因此，我们的研究不仅在我们对结核分枝杆菌中TNT的分泌和可能的其他蛋白的理解上取得了重大进展，而且还描述了结核分枝杆菌中Esx-paralogs及其在革兰氏阳性菌中大型WXG100蛋白家族中的同源蛋白的生物学功能。”

TNT是结核分枝杆菌外膜蛋白CpnT的两个结构域之一;巨噬细胞胞浆中CpnT的TNT结构域活性通过水解NAD+诱导巨噬细胞死亡。结核分枝杆菌有一个内膜和一个外膜，一种蛋白质需要穿过每一层才能被分泌到细菌外面。CpnT如何到达外膜是未知的。

EsxE和EsxF与CpnT属于同一个基因片段，UAB研究人员推测这两个小蛋白可能参与了毒素的分泌。

通过创建缺乏EsxE或EsxF的不同菌株，他们发现这两种蛋白都是CpnT转位到结核分枝杆菌细胞表面以及将TNT分泌到感染结核分枝杆菌的巨噬细胞的细胞质中所必需的。此外，EsxE和EsxF是结核分枝杆菌表面可及的蛋白，是一种膜相关复合物。

为了更多地了解这种易位的机制，UAB团队对每个Esx蛋白进行了突变，其中每个蛋白上单一WXG基序的色氨酸氨基酸被氨基酸丙氨酸取代。突变体表明，在EsxE和EsxF上完整的WXG基序是CpnT有效转位到结核分枝杆菌外膜和随后TNT分泌到感染巨噬细胞的胞浆中所必需的。

水溶性EsxE和EsxF蛋白的纯化表明，它们形成了EsxE-EsxF二聚体，其中五种二聚体组装成星形结构，电镜观察可见。每一个直径约为10纳米，有一个3纳米的中心孔。

平面脂质双分子层实验是理解EsxE-EsxF分子功能的关键，因为他们表明EsxE-EsxF孔形成了通过脂质膜的通道。

最后，研究人员发现WXG基序对于EsxE-EsxF复合物的孔形成和膜破坏是必需的，并且这些基序介导了功能性EsxE-EsxF寡聚物的组装。这现在定义了以前神秘的WXG基序的生化作用。

“EsxE和EsxF构成了第一个已知的介导结核分枝杆菌蛋白分泌的外膜成分，”Niederweis说。“然而，EsxE和EsxF不太可能满足TNT的分泌，因为所有已知的细菌蛋白质分泌系统都需要能量来源。因此，EsxE-EsxF可能与其他蛋白或蛋白复合物结合，实现CpnT出口和TNT分泌。”

UAB的研究人员提出了EsxE和EsxF两种CpnT转运模型。首先，EsxE-EsxF异质二聚体在内膜上形成一个孔，然后在外膜上形成另一个孔，形成跨膜通道。“另外，”Niederweis说，“内膜通道通过纤维形成延伸到周质，并连接外膜上的EsxE-EsxF孔，暴露细胞表面的EsxF。在这个模型中，假定的EsxE-EsxF通道使CpnT多肽出口到结核分枝杆菌的外膜，并随后分泌TNT和EsxE-EsxF。”

与Niederweis共同发表在《自然通讯》上的这项研究，“形成孔的Esx蛋白介导结核分枝杆菌的毒素分泌”，作者是UAB微生物学系的Uday Tak和Terje Dokland。

“这项工作是杰出的研究生乌代·达克(Uday Tak)的非凡成就，他几乎独自完成了所有这些实验，”尼德韦斯说。乌代·达克于2020年11月获得博士学位，现在是科罗拉多大学博尔德分校的博士后研究员。