研究背景

肝癌细胞（HCC）经常侵入门静脉系统并且发展成为门静脉肿瘤血栓（pVTT）。长脸非编码RNA是一类不能够编码蛋白质，并且长度大于200bp的具有生物学功能的RNA。有研究报道，其对肝癌发生具有重要影响。但是其具体的关联却并还没有详细的研究。在此，清华大学联合上海东方肝胆医院研究人员通过对20个病人的60个临床样本进行RNA-Seq鉴定到了8603个可能的lncRNA。其中917个lncRNA在TCGA数据库以及发表的肝癌数据库中有关联，235个lncRNA存在CNVs和DNA甲基化变化。很多与lncRNA共表达的基因富集在细胞粘着、免疫反应以及代谢过程等通路上。HAND2-AS1还通过RNAi的敲降进行了部分功能研究。因此，可以说研究人员对lncRNA在肝癌的肿瘤发生与转移过程中提供了有用的资源。

研究思路



研究结果

鉴定临床样本中肝癌细胞的lncRNA

为了系统鉴定肝癌发生与转移细胞中的lncRNA，研究人员收集了20个临床病人的60歌样本进行了全转录组的RNA测序(该服务由伯豪生物提供)。其中，每个病人分别收集原发灶、临近的正常组织以及pVTT样本。一共鉴定到了20345个蛋白编码基因，13870个GencodeV19鉴定的lncRNA以及8603个新的lncRNA。分析流程如图1。



图1: 数据分析流程。

候选lncRNA的鉴定

对这些新的lncRNA在基因组位置、表达丰度、转录本长度、保守性以及SNp分析发现，74%的lncRNA定位于基因间区域，16%为反向lncRNA，只有3%定位于基因内含子区域。新的lncRNA在转录本长度上比蛋白编码基因要短一些，却长于GENCODE的lncRNA。从保守性来讲，新的lncRNA保守性更差，相比较而言，外显子区域的保守性要强于内含子区域（图2）。



图2: 新lncRNA的鉴定。

肿瘤与pVTT中的lncRNA

研究人员使用统计学的方法对肿瘤与pVTT的lncRNA表达模式进行了统计。结果发现，原发灶的lncRNA和正常组织相比表达量远比转移组织lncRNA的差异大得多（图3）。



图3: 肿瘤与pVTT中的lncRNA表达分析

lncRNA与公共临床数据库的分析

通过将lncRNA测序数据与Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 数据库的数据比对后发现，测序的数据与公共数据库中的数据具有较好的一致性（图4）。



图4：lncRNA与公共临床数据库的比对。

鉴于此，研究人员认为lncRNA可能可以作为肿瘤的生物标志物用于临床诊断。因此，研究人员筛选了其中一个lncRNA Rp11-166D19.1并且应用于临床的生存率研究。结果发现，该lncRNA高表达的情况下，临床病人生存率显著升高。



图5：Rp11-166D19.1作为生物标志物的研究。

lncRNA的CNVs与DNA甲基化研究

研究人员对lncRNA还进行了CNVs以及甲基化的研究（图6）。对于CNVs的研究，研究人员使用了Affymetrix CytoscanHD芯片(该服务由伯豪生物提供)。给予GISTIC的分析，4个染色体位点显著扩增，70个染色体位点显著缺失（图6）。在这些染色体区段中，染色体位点显著缺失的区段中存在147个lncRNA，而染色体位点显著扩增的区段中则没有lncRNA存在。

此外，研究人员还使用了DNA甲基化芯片（Illumina Infinium HumanMethylation 450 k服务由伯豪生物提供）对60个样本进行了甲基化检测。结果发现，93个lncRNA的表达和甲基化之间存在关联（图6）。其中，HAND2-AS1的启动子区域在肿瘤细胞中存在超甲基化情况（图6）。



图6: lncRNA的CNVs与DNA甲基化研究

lncRNA共表达网络构建

为了预测lncRNA的功能与调控机制，研究人员构建了lncRNA与其互作的蛋白编码基因的调控网络图（图7）。在预测到的43个网络簇中，有4个簇中肿瘤相关的lncRNA显著富集（图7）。其中，第25个簇中的蛋白编码基因包括了和肿瘤转移相关的细胞粘着以及TGF-b通路。并且，很多肝癌驱动基因也富集在了这个网络中（图7）。



图7: lncRNA共表达网络构建。

肿瘤转移相关的lncRNA功能研究

为了研究单个lncRNA对肝癌的调控关系，研究人员挑选了10个在之前研究中认为和肝癌相关的lncRNA，并对其进行了RNAi沉默（图8）。结果发现，Rp11-166D19.1，HAND2-AS1以及XLOC_015969的RNAi细胞系均表现出了不同的对肿瘤细胞的影响（图8）。

图8: 肿瘤转移相关的lncRNA功能研究

小结

长久以来，肿瘤的生物标志物一直都是较多的局限于对蛋白编码的基因的检测。而在本工作中，研究人员通过对肝癌细胞的lncRNA转录组测序与CNVs以及甲基化检测，确认了在肝癌细胞中新的lncRNA同样具有生物标志物的潜在临床价值。

原文出处：
Yang Y, Chen L, Gu J,et al. Recurrently deregulated lncRNAs in hepatocellular
Carcinoma. Nat Commun.2017.