CRISpR/Cas9基因组编辑技术给整个学术界和工业界带来了革命性的变化，有数以千计的实验室在用该技术进行生物科学研究，然而关于该系统的一些基础性问题却依然是个谜团，引人深思。


CRISpR简介


CRISpR/Cas9 (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISpR-associated protein 9)技术是近十几年发展的一种准确、高效率、便捷的生物基因编辑技术，已经成为一种非常热门的基因组编辑工具。CRISpR即有规律的、成簇的、短间隔回文重复序列，它原本是存在于细菌和古细菌基因组中含有多个短重复序列的基因位点，能够为机体提供一种特异性免疫保护机制，抵抗外来质粒、病毒等遗传物质的入侵，其主要依赖的是Cas9核心蛋白，在RNA的介导下，Cas9蛋白能够识别目标序列进行切割造成DNA的双链断裂。该基因编辑系统仅需要短的gRNA (guide RNA)和核酸酶(Cas9)就可以实现对特定的生物靶基因进行定点突变；该技术的快速发展，为生物基因编辑技术的发展注入了新的活力。


CRISpR技术起源自哪里？


CRISpR系统的生物学优势非常明显。原核生物（细菌等）以及生活在极端环境中的不知名单细胞生物（如古细菌）面临着入侵者外源核酸的持续攻击。病毒的数量以10：1的比例远超过原核生物，根据推算每两天病毒就可以杀死世界上一半的细菌。原核生物还可通过质粒来交换DNA片段，一旦交换的DNA 能“绑架”宿主菌中生长过程的关键分子来维持自身稳定时，则该质粒具有使宿主菌致病的能力。


然而原核生物也进化出了一系列应对外源基因侵袭的“生化武器”。比如，限制性内切酶就是一种能在靠近DNA特定序列位点进行切割的蛋白酶。但是这种防御功能非常迟钝，因为每种内切酶只能靶向切割特定的基因序列。而动态的CRISpR/Cas系统却更加灵活，因为它会采取类似感染时抗体发挥长期免疫作用的机制，对入侵的外源性核酸进行及时的免疫应答和免疫记忆。


Mojica等研究者在观察到了CRISpR系统中的回文重复序列有时能与病毒基因组序列相匹配后，便对CRISpR/Cas的功能进行了深一步的研究。研究发现当细菌和古细菌暴露于特定的病毒或质粒时，某些特定的Cas蛋白可以把一些间隔序列添加至基因组中。然后由这些间隔序列转录的RNA引导其他Cas蛋白靶向任何能匹配间隔序列的外源性DNA/RNA并对其进行切割。


至于细菌和古细菌为何能拥用如此复杂的免疫系统，至今还没有得到解答。但是目前主流理论认为CRISpR系统来自于“跳跃的基因”——转座子（Transposon），可以从基因组的一个位置转移到另一个位置。美国国家卫生研究院的进化生物学家Eugene Koonin和他的同事发现了一类可编码Cas1蛋白的移动基因，Cas1能将间隔序列插入基因组中。他们认为这些“Transposon”可能就是CRISpR/Cas免疫系统的起源。目前研究者正在对这些DNA转座子的转移过程及追踪机制进行深入研究，并希望以此来揭示CRISpR/Cas系统的复杂性。


CRISpR-Cas系统作为新型基因编辑技术的原理


细菌和古生菌由于长期生存在充满噬菌体、质粒或者其他病毒的大自然环境里，在长期与这些病毒生存的抗争中，其进化演变出了很多种防御系统，CRISpR/Cas系统便是其中最有效的防御系统之一。CRISpR/Cas系统的机制比较复杂,目前还未能完全明白整个过程,大致可分三个阶段:a.新spacer的获得;b.CRISpR RNA的合成;c.靶点的干扰。第一阶段即将外源入侵的噬菌体或质粒中的小段DNA序列插入整合到自身的基因组内,这一小段外源DNA被插入到两个repeat之间。而该系统识别外源与自身DNA序列的一个标识是pAM序列(protospacer Adjacent Motif),—般为NGG,位于外源序列的3"端。CRISpR RNA的合成是一个复杂的生化过程，己知在typeII CRISpR系统中tracrRNA与pre-crRNA的repeat结合成一个二元复合物,然后作为底物被typeII CRISpR系统切割，还有Cas9的参与，随后经另一种核酸酶修饰切掉5"端的其它repeat。第三个阶段crRNA与Cas蛋白结合形成CRISpR核糖核蛋白复合物，进而识别外源入侵的碱基序列。简单来说，CRISpR/Cas9系统以外源入侵的核酸序列(spacers)为模板,合成小分子的RNA(crRNA),然后crRNA与Cas蛋白结合成效应复合体来沉默以后入侵的外源碱基序列。现在已经清楚，CRISpR/Cas系统是存在于细菌和古细菌内的一种获得性免疫体系。借助于这一系统，细菌和古细菌可以将外源入侵的噬菌体或质粒的DNA存储到系统内，作为一种"记忆"，待下次入侵时发挥免疫作用，达到保护自身的目的。对于CRISpR/Cas系统的工作机理，目前还没有彻底研究清楚，许多作用细节还未知，并且不同类型系统的机理也有差别。而其中Type ll作为结构最简单的类型，已经被研究者们改造为强大的基因编辑工具，现在已经成为生物研究领域有力的基因编辑方法和手段。


CRISpR应用范围


在科研领域，CRISpR/Cas可以帮助构建模式生物，通过基因工程手段在多种模式生物中构建疾病样本，帮助人类疾病研究。目前已经实现了利用CRISpR/Cas 技术对传统模式生物，如线虫、斑马鱼、果蝇等进行遗传学改造，另外在狗、山羊、猴、猪等动物中也已经被证实是有效的。


在农业领域，CRISpR/Cas可以加速对植物基因组的改造，提高农作物产量、加强农作物抗病能力。在中国耕地面积稀缺的大背景下，改良农作物的需求尤为急迫。


在遗传病治疗领域，CRISpR/Cas的高精确度、低脱靶率大大提高了通过改造体细胞基因以缓解甚至治愈遗传病的可能。目前已有科研报告显示，CRISpR/Cas技术的应用治愈了患有酪氨酸血症的成年小鼠。在细胞层面，CRISpR/Cas技术实现矫正ipS细胞中导致β-地中海贫血症的HBB突发。


在传染病治疗领域，CRISpR/Cas的应用更为直观。CRISpR/Cas系统切除人体细胞中的外来病毒基因并灭活病毒，这一过程和细菌体内的免疫过程类似，只需要精确切除目标序列而无需引入其他基因序列。科研实验已经证明CRISpR/Cas系统对HIV病毒及HBV病毒在细胞层面的有效抑制。


在癌症治疗领域，CRISpR/Cas可以帮助CAR-T细胞治疗提供更有效更广泛的应用。CRISpR/Cas的精准定位可以解决目前CAR-T疗法由于插入位点随机引起的安全性问题，另外也可以用于定位敲出健康人T细胞的个体化相关基因以将其引入患者体内进行治疗，或者在患者体内定向敲除免疫排斥反应相关基因以达到异体治疗的目的。目前已有报道使用TALEN技术编辑CAR-T细胞治愈了一名患有耐药性白血病的小女孩。借助更加精确、高效的CRISpR/Cas技术，CAR-T细胞治疗方法的前景将更值得期待。


CRISpR技术照亮肿瘤治疗之路


2016.11.15 Nature主页报道全球首个CRISpR技术的人体应用已在中国启动，10 月 28 日首名非小细胞肺癌患者接受了经CRISpR技术改造的T细胞的治疗，四川大学华西医院卢铀团队采取以下技术路径将CRISpR/Cas9用于非小细胞肺癌患者的治疗；从招募的患者体内分离出 T细胞，并利用 CRISpR技术对这些细胞进行基因编辑，敲除这些细胞中抑制免疫功能的pD-1基因，并在体外进行细胞扩增。当细胞达到一定量后，将它们输回患者体内对肿瘤进行杀伤。在7月 6 日获得华西医院伦理委员会批准后 ，10 月 28 日首名非小细胞肺癌患者已经接受了经 CRISpR技术改造的 T细胞的治疗，目前卢铀 小组表示治疗实验进展顺利。全球首个CRISpR临床试验顺利在中国推进将对国内精准医疗领域形成强有力催化，国内精准医疗投资迎来投资风口。


CRISpR受到资本市场的追捧


CRISpR技术自2012年被应用以来受到了广泛的关注，并且发展迅速。美国已有数家CRISpR技术公司成立并吸引了大量投资。其中由CRISpR技术发明人之一张峰创始的Editas Medicine已于2016年2月8日于纽交所通过IpO成功融资9440万美元。


A股投资标的筛选


结合CRISpR技术、临床进展、适应症和靶点，重点关注具备技术领先优势的企业。


银河生物(000806)

2015年5月发布公告，斥资5亿元以增资并购方式取得投资标的南京生物的90%股份。南京生物是南京大学生物医药研究院和南京大学模式动物研究所的产业化平台，在利用各种基因编辑技术制作转基因模式动物上具有领先的技术和经验。未来将启动模式动物全球销售渠道建设，和肿瘤免疫治疗药物筛选和检测平台、转基因小鼠人源化平台建设以及基于平台所开发、引进创新型大分子药物产业化(含治疗肺癌、肝癌、淋巴瘤、肝硬化、帕金森氏症以及类风湿关节炎等疾病的新型药物)，为上市公司布局精准医疗产业链奠定基础。


东富龙(300171)

增资9000万元获得上海伯豪生物技术有限公司34.0206%的股权，成为伯豪生物第一大股东。伯豪生物的主营业务为生物CRO技术服务业务，可提供基因组编辑技术CRISpR/Cas9技术定制服务，已完成胃癌、肺癌、Hela、293T、肝癌等细胞的建系、20多种肿瘤细胞系CRISpR/Cas9测试、15个Gene的敲除和2个miRNA的删除等。2015年12月31日，公司发布公告拟投资不低于1亿元设立重庆精准医疗产业技术研究院，未来东富龙医疗将逐步建立基因测序、分子诊断、细胞治疗三大平台，打造精准医疗研、产、销为一体的大生态系统。


澳洋科技（002172）

2015年12月公告参股2%吉凯基因。吉凯基因已完成1亿元B轮融资，具备CAR-T和CRISpR/Cas9 技术，有望成为国内首个开发2.0版CAR-T的公司。


安科生物（300009）

和苏州博生吉合作推进CAR-T疗法。博生吉是国内首家拥有CAR-T细胞/CAR-NK细胞技术服务平台的公司，采用最先进的CRISpR/Cas9基因编辑技术进行处理。已成功构建第二代、第三代和第四代CAR-T系统，具备MUC1靶点的实体瘤CAR-T疗法。2015年11月份和武警安徽/浙江总院开展实体肿瘤CAR-T 临床试验，目前在志愿者征集过程。


恒瑞医药（600276）

与深圳源正细胞医疗技术有限公司合资成立恒瑞源正生物科技有限公司。源正细胞医疗技术有限公司目前正在研发CAR-T 细胞技术，储备有近二十个靶点；2013 年起在中国开展细胞治疗随机对照的多中心临床试验，具备细胞治疗临床试验经验。