红血球（RBC）占哺乳动物循环细胞的大部分，主要负责向远处的细胞组织输送氧气，是有氧呼吸的重要组成部分。一直以来都认为红细胞是免疫惰性的，只有很少的研究描述过红细胞别的其他功能——例如趋化因子调节、补体结合和病原体固定。美国宾夕法尼亚大学的研究人员最新研究表明，红细胞是炎症反应的重要组成部分!红细胞通过细胞表面表达核酸敏感的Toll样受体9（TLR9）作为关键的免疫传感器，结合来自细菌、疟原虫和线粒体的DNA的CpG，这种携带CpG的红细胞能促使脾巨噬细胞加速吞噬红细胞、促进先天免疫激活——其特征是干扰素信号通路细胞的上调。在CpG诱导的炎症和败血症过程中，“特异性缺失红细胞系的TLR9“可消除红细胞吞噬功能，并降低局部和全身细胞因子的产生。表达TLR9的红细胞能检测和捕获核酸，调节红细胞的清除和炎症细胞因子的产生，表明红细胞在病理状态下起着免疫前哨的新作用。

关键的介导分子TLR9在红细胞表面表达

进化上保守的核酸传感Toll样受体（TLR）能够识别来自病原体和自身的核酸、并通过促进炎性细胞因子的分泌，免疫细胞的成熟和增殖，在炎症反应中发挥核心作用。游离的含CpG的DNA升高通常是感染/无菌受损的标志。这些炎症病理的共同点是急性贫血（acute anemia）——这是在败血症和危重疾病期间观察到的发病率的重要原因。多项研究表明，细胞内核酸和单核细胞和巨噬细胞中的 TLR 信号传导在炎症性贫血和血细胞减少症中发挥某种作用；然而，红细胞本身或游离DNA是否与红细胞清除相关是未知的。

Metthew Lam团队之前的研究表明，红细胞在稳态条件下表达细胞内 TLR9， 并清除无细胞（含 CpG）的线粒体 DNA (cf-mtDNA)。这表明TLR9 介导的红细胞对 cf-mtDNA 的清除代表了一种可以从健康宿主的循环系统中清除有毒的无细胞核酸的保护机制。然而，RBC 依赖性的CpG 结合在感染期间会如何响应炎症反应仍然未知。新发表在《转化医学》的研究结果表明： TLR9 在红细胞表面表达，在炎症状态期间红细胞TLR9 与 DNA 结合导致红细胞清除加速和全身炎症，从而将红细胞-核酸结合与炎症状态期间的先天免疫激活和贫血联系起来。

败血症期间红细胞表面 TLR9 增加，红细胞与病原体 DNA 结合
虽然TLR9是内体（endosomal）核酸敏感受体，最近的研究已经确定了TLR9的肠上皮细胞、脾树突状细胞、活化的血小板、和一小部分外周血单核细胞的表面上存在，当使用针对 TLR9 胞外域中较大表位的抗体时，很容易在完整的非透化人和鼠 RBC 上检测到 TLR9。作者使用共聚焦显微镜验证了 RBC TLR9 的表达。来自非人类灵长类动物黑猩猩的红细胞表面也表达 TLR9，TLR9 表达在哺乳动物 RBC 中是保守的，在 RBC 表面具有 DNA 结合胞外域。

具免疫刺激性的未甲基化 CpG motif是微生物 DNA 的一个特征。通过将来自健康人类供体的RBC 与来自嗜肺军团菌的基因组 DNA或来自恶性疟原虫红细胞培养物的培养基一起孵育，结果表明人类红细胞可以结合病原体 DNA。

含有 CpG 的线粒体 DNA是TLR9的配体，在败血症期间在循环中升高，而败血症是一种由宿主对感染的反应失调定义的致命综合征。从败血症危重患者血液样本和健康供体比较分析，发现败血症血液样本红细胞表面表达的TLR9升高，RBC 上的 mtDNA 也同样升高。

而败血症小鼠模型、细菌性肺炎小鼠模型、全身寄生虫（嗜肺军团菌和弓形虫）感染小鼠模型的动物实验表明，与血浆相比红细胞上的 mtDNA 升高，说明在肺炎、寄生虫感染和多种微生物感染期间，含 CpG 的 mtDNA 被隔离在红细胞上。

CpG DNA 结合导致红细胞结构和功能改变

由于红细胞形态改变是败血症，重大疾病的共同特征，研究人员分析了过量的游离细胞的CpG对红细胞形态和功能的影响，并且用另一种结合 TLR9 而不会引起 TLR9 激活或构象变化的GpC DNA（注意，不是CpG）作为对照。电镜和流式分析结果表明，相比对照，低浓度的细胞外 CpG DNA 存在下，红细胞在形态上保持不变；越来越多的 CpG 导致红细胞畸形，发生变形的都是TLR9阳性的红细胞。这最终表明TLR9 胞外域的表面可及性可通过 CpG 暴露进行调节，并且 CpG 与 RBC 的结合会改变红细胞的结构和功能。

红细胞与 CpG 结合导致 CD47抗吞噬表位 检测不到
红细胞存活率由多种因素决定，包括膜完整性、磷脂酰丝氨酸 (pS) 外化和 CD47 表达。实验结果表明，CpG 不会导致红细胞膜完整性的丧失，但是会导致CD47抗吞噬表位无法用特异性抗体CC2C6检测到。并且，这种抗体检测阴性（CD47改变）的细胞上所结合的CpG分子比抗体检测阳性（CD47正常)细胞更多。进一步实验证实，TLR9和CD47两种蛋白共免疫沉淀。共聚焦分析显示，CpG 结合后红细胞膜的形态学发生改变，TLR9 阳性/CpG 阳性细胞表现出膜的改变以及 TLR9 和原本均匀的CD47 聚集（或可用二者共免疫沉淀解释），CD47发生改变，特异性抗体CC2C6检测不到——但是用另一个用于检测老化、结构改变/受损CD47分子的抗体2D3检测显示升高了。因此可以表明CD47检测不到是由于其结构改变而不是其他原因。用疟原虫培养上清液孵育人类幼稚红细胞也会导致抗吞噬表位的大量丢失。

结合CpG的红细胞引发红细胞吞噬作用加速并启动先天免疫反应 CpG 诱导的炎症依赖于 RBC-TLR9

CD47构象改变导致脾巨噬细胞 (RpM，red pulp F4/80-positive splenic macrophages)加速吞噬清除红细胞。那么红细胞暴露于高浓度的 CpG DNA 会导致体内红细胞吞噬作用加速吗？

为了分辨CpG红细胞在启动系统性免疫中的作用，研究人员用了一个简化还原模型：用携带CpG的红细胞灌注小鼠活体后分析比较脾组织变化。相比磷酸缓冲液处理的对照，CpG-RBC输注后 6 小时的脾组织学分析显示中性粒细胞浸润增加和红髓拥塞增强（red pulp congestion）； 脾组织RNA 测序（RNA-seq）表明与 pBS 处理的红细胞对照相比，CpG-RBC 引发了一种转录组学反应，其特征是干扰素 (IFN) 信号通路基因的表达增加。对比对照，小鼠血浆 IFN-γ 和白细胞介素 (IL)-6 在输注 CpG 处理的红细胞 6 小时后表达升高。IFN-γ在介导噬血细胞淋巴组织细胞增生中起中心作用，其特征是加速吞噬红细胞，并常常在败血症和感染观察到。总的来说，这些数据表明携带 CpG 的红细胞加速了对红细胞吞噬作用并启动了局部和系统性免疫反应。这也启发人们，用阻断抗体或拮抗性小分子抑制剂靶向 RBC-TLR9 可能是对抗炎症性贫血的可行选择。这可能会消除增强的 CpG-TLR9 介导的 RBC 吞噬作用，而不会干扰对宿主防御至关重要的经典免疫细胞中的 CpG-TLR9 信号传导。

为了了解红细胞 TLR9 在体内先天免疫反应中的作用，研究人员还定制了模式小鼠：红细胞 TLR9 KO 小鼠（红细胞tlr9-/-小鼠 (Ery tlr9-/- )， 红细胞不表达 TLR9。红细胞 TLR9 的缺失会改变宿主的免疫反应。研究人员对野生型和 Ery tlr9-/-小鼠进行了 CpG 诱导炎症的还原模型，还用败血症盲肠匀浆模型注射野生型 和 Ery tlr9 -/-小鼠。注射导致野生型小鼠的红细胞-mtDNA结合增加，但在Ery tlr9-/-小鼠没有观察到。缺乏红细胞 TLR9 的情况下，脾的 IL-6 和 TNF-α 的产生相比野生型降低。血浆 IL-6水平与野生型中红细胞结合的 mtDNA 相关，但与 Ery tlr9-/-小鼠无关。实验结果表明，红细胞在败血症期间获得CpG-DNA，而红细胞- TLR9依赖的DNA传递驱动了败血症期间的局部的先天免疫反应。

讨论

这项研究确定了红细胞在对感染的免疫反应中的新作用。哺乳动物红细胞表达细胞表面 TLR9，可以结合含 CpG 的游离 DNA。红细胞结合的 mtDNA 在人类败血症和 COVID-19 中升高，并与贫血有关。在循环游离 DNA 浓度较低的基础条件下，红细胞结合 CpG DNA 并充当“缓冲水库”，而不会发生明显的形态变化。然而，当血浆 CpG DNA 高时，例如在败血症、肺炎或疟疾感染期间，TLR9 依赖性 CpG DNA 结合会导致红细胞形态的根本改变、部分红细胞上 CD47 的功能丧失、红细胞吞噬作用加速、由此驱动的先天免疫激活。

人类每秒产生超过 200 万个红细胞，并且在线粒体自噬和核排出过程中面临暴露于大量 DNA 的风险。TLR9 保留在红细胞上，可通过清除那些从线粒体自噬中逃逸出来的线粒体 DNA 来保护红细胞成熟过程中的红细胞。最近的研究表明，线粒体自噬的丧失会导致红细胞破坏和贫血；线粒体自噬逃逸的 mtDNA 会导致细胞自主性 TLR9 介导的炎症。虽然需要进一步的研究来阐明 TLR9 在红细胞发育中的潜在作用，研究证实了 TLR9 对成熟红细胞在急性炎症期间调节免疫反应的作用。

COVID-19患者中红细胞结合的mtDNA的升高与患者疾病严重程度和贫血相关，这些结果强调需要进一步研究红细胞免疫功能，这对于全面了解对病原体和无菌损伤的先天免疫反应至关重要。如果红细胞的 CpG 传递驱动了各种炎症性疾病中 IL-6 的产生，那么靶向 RBC-TLR9 可能是治疗细胞因子风暴的有效方法，而不会伴随单克隆抗细胞因子抗体疗法发生的免疫抑制。或者，可以在疫苗和免疫疗法的开发中利用红细胞介导的 CpG 递送。

这个研究有几个局限性。需要进一步的体内研究来全面了解红细胞-TLR9 如何调节红细胞吞噬作用后的先天炎症反应。尽管观察到 CpG 结合后 CD47 的掩蔽和形态学变化，但其他机制也可能有助于加速败血症期间红细胞的红细胞吞噬作用。在单细胞水平上分析脾脏、肝脏和骨髓中的红细胞吞噬细胞对于确定携带 CpG 的红细胞进行先天免疫调节的确切机制是必要的。此外，虽然没有观察到 CpG 结合后红细胞内的细胞质信号传导，但通过 TLR9 发生的功能和形态变化可能是红细胞膜上发生的间接信号传导事件的结果。RBC-TLR9 的进一步深入结构分析对于开发针对 RBC-TLR9 的特定抑制剂或疗法非常重要。

作者认为，在静息状态下，红细胞以细胞表面表达的TLR9 作为特定的 DNA 传感器有助于促进清除痕量 CpG 以防止非特异性炎症。然而，在循环 CpG过量的条件下——例如败血症和 COVID-19，RBC-TLR9 与 CpG 的结合会导致加速清除红细胞和炎症发生。这种先天免疫机制可能有利于清除受损的红细胞，并且可能在游离DNA 升高的病理状态下导致全身炎症和贫血的发展。红细胞借助TLR9识别CpG DNA，为 红细胞作为免疫哨兵提供了真正的证据。近二十年的研究渐渐确认了去核细胞血小板在先天免疫和适应性免疫中的作用，这与确认红细胞具免疫功能的研究结果一致。因此需要进一步研究血小板、红细胞和凝血在先天免疫反应中的合作，才能真正更全面了解血液中的先天免疫机制。