CAR-T细胞治疗在部分血液学恶性肿瘤的临床试验中显示出了令人惊喜的疗效——如儿童弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和套细胞淋巴瘤，观察到的儿童总缓解率为81%，成人为83%，已经获得FDA临床批准的CAR-T疗法有tisagenlecleucel（诺华制药Kymriah)、axicabtagene cilleucel（吉利德旗下Kite制药的Yescarta）和brexucabtagene autoleuel(吉利德旗下Kite制药的Tecartus)。这极大地促进了CAR-T技术的各种临床应用研究，包括怎样可控、可诱导地构建更复杂的CAR-T细胞用于其他血液病和实体瘤，甚至自体免疫病、心脏病等的治疗。虽然绝大多数研究都在努力寻找更专一有效的靶点，但是制备CAR-T细胞也是关键的技术瓶颈。如何快速、高效且安全的将患者T细胞构建为CAR-T细胞，是亟待解决的巨大挑战。目前的常规方法是利用病毒载体如慢病毒、伽马逆转录病毒或转座子，这些载体有潜在的遗传毒性风险，构建复杂，需要兼顾提高基因表达和降低载体毒性，耗时长，费用昂贵。T细胞本身作为适应性免疫的关键参与者，对免疫原性外源性DNA非常敏感，常规病毒载体转染后会导致迅速丧失功能或诱导凋亡，给CAR-T细胞治疗带来的更多不确定性。

面对越来越多的患者需求，在一个有意义的治疗时间窗口内为众多肿瘤患者构建CAR-T细胞，这迫切需要开发一种高效、快速、多功能和安全的基因工具来构建重组T细胞。mRNA疫苗这阵子大热，可惜通过mRNA转染的CAR基因工程虽然能克服载体风险，但只能提供瞬时表达不合适用于CAR-T构建。在这项新研究中，德国科学家们开发了非整合型的、小DNA载体nano-S/MARt (nS/MARt)，证明其可以有效地用于人类T淋巴细胞的工程，还能增强生成转基因细胞的能力。该载体平台不含病毒成分，能够在分裂细胞的细胞核内、染色体外复制，在人类T细胞中提供持久的转基因表达，而不影响其行为和分子完整性。研究人员提供了一种生产方案，能在临床规模的封闭系统中快速生成嵌合抗原受体(CAR) -T细胞，并从体外和体内实验中证明了新载体与现有病毒载体相比，增强了抗肿瘤活性。

作为适应性免疫系统的关键参与者，T细胞对免疫原性外源性DNA非常敏感，在使用常规病毒载体转染后，它们会迅速丧失功能或诱导凋亡。研究人员开发了一种纳米s /MARt (nS/MARt)载体，能在给T细胞活性造成最小的破坏的同时提供稳定的表达。这种新的DNA载体平台是基于支架/基质附着区(S/MAR)基序，可以积极介导有丝分裂活性细胞中DNA载体复制和游离体episome的维持。S/MARs通常被定义为在间期期间将染色质锚定在核基质蛋白上的基因组DNA序列。这种结合介导了环状结构域（looped）的产生，在功能上能调节基因的表达和基因组的复制，在结构上参与细胞核中DNA紧密折叠。S/MARs的大小范围为60 - 5000个碱基对(bp)，以丰富的AT含量为特征，虽然它们在物种间进化保守，但它们没有一致的序列。通过反复的消除CpG、选择标记物最小化、谨慎选择复制起点、根据经验的启动子设计和消除隐蔽的真核信号，nS/MARt载体可以有效地转染到原代人T细胞中而不产生毒性。这种新的DNA载体系统是基于无抗生素纳米载体技术;不含免疫原性和成分，只包含临床批准的序列，可实现简单轻松、更具性价比的CAR-T细胞制备。结合研究人员优化的流式电穿孔和自动化的细胞培养，他们还提供了一种适应临床规模的封闭生产流程，可以实现从1×109的T细胞中生产出6×108 的重组T细胞，其中55%能稳定表达CAR，从纯化T细胞起只需5天时间完成！——这将是推动CAR-T细胞疗法朝着更可持续和更普及的方向迈出的重要一步。

看！如何用大家熟悉的分子克隆操作，构建出这个惊人效果的新路线的。
首先作者选择了一个DNA载体pEpI，去除了非必需元件，只留下细菌复制子和卡那霉素抗性筛选基因，将载体从3kb缩小到1.5kb。在CMV启动子驱动的真核细胞表达盒中，研究人员将嘌呤霉素抗性筛选基因和GFp报告基因连在一起，GFp-puro表达盒的转录终止于人IFN-β簇分离而来的S/MAR序列中间，这个设计能促进其功能——在染色体外维持质粒DNA存在。通过这一轮改造得到一个功能提高、能在HEK 293T和HeLa细胞中稳定表达的载体pS/MARt。通过用Luke 等人介绍的无抗生素筛选系统替换细菌Ori和卡那霉素抗性基因，进一步减少了质粒大小。Stehle等人曾经证实，通过S/MAR基序的转录活性是维持其功能必须的，然而包含AU-rich elements (AREs) 的mRNA转录本会被人类抗原R识别并迅速降解。由于S/MAR是富含AT的基因组序列，研究人员通过引入剪切位点去掉了来自S/MAR非必需的序列和ARE，获得了更稳定的Sp-nS/MARt-B 载体。然后，研究人员用来自载脂蛋白apolipoprotein B (ApoB)的更紧凑形式S/MAR替换了IFN-β S/MAR，通过实验证实最后版本的Sp-nS/MARt-A 纳米载体是最佳的，不但转染效率最高，产生克隆最多，GFp表达最强（转染24小时后）。这还没完，研究人员用来自人EF1α 启动子替换掉了CMV启动子，把最后一点病毒序列也去掉了。在Jurkat76 (J76) 细胞中证实，新载体能持续稳定表达，80%的活细胞都能表达报告基因。更强的是，研究人员分离出表达GFp的细胞，培养360天后依然能检测到GFp稳定表达，每个细胞有1.71个游离性拷贝，超长待机，还不会整合到染色体上。转染细胞和未转染对照细胞的增殖没有明显区别，表明载体对细胞毒性影响很小，也不会改变CD4和CD8比例。用pEpI载体对照转染27天后GFp几乎都消失而Sp-nS/MARt-A转染的仍有40%具有GFp表达。这些都表明，新载体用于制备CAR-T细胞应该非常有优势。

在三种异种移植小鼠模型中验证新载体的威力。

以CEA为例，研究人员用pGK (phosphoglycerate kinase) 启动子和人癌胚抗原CEA替换掉GFp，构建了Sp-nS/MARt-CEA，用电穿孔转染构建CAR-T细胞。与用慢病毒载体比较，新载体CAR表达水平更高，在肿瘤缩小、肿瘤生长延迟、延长生存期，肿瘤浸润率等方面都更优，但两者都没有彻底清除肿瘤，原因是出现肿瘤逃逸，肿瘤细胞抗原丢失。这在临床治疗中很常见。RCA方法检测证实载体以质粒形式存在，没有整合到染色体上。处理40天后将转染细胞与肿瘤细胞混合培养依然显示强大的抗肿瘤活性。另外两种肿瘤模型都显示出新载体制备CAR-T细胞效果优于，至少效果不输给现有方法，而具有持久表达，遗传风险小，制备简单快捷这些优势就更不用说。

GMp标准生产CAR-T细胞

最后作者介绍了他们构建的一套CAR-T细胞生产线路：利用德国美天旎的CliniMacs系统纯化采集的T细胞，利用全自动细胞培养系统，GTx ExpERT (MaxCyte)大规模流式电转系统，能够在5天时间内从10.35 × 109个血液细胞中纯化出1 × 109个T细胞，并最终获得3.6 × 108个经过验证具有功能的CAR-T细胞。如果这一系列最后能够商品化，将必然给CAT-T细胞治疗的开发和推广应用带来巨大深远的影响。

给实验室CAR-T研发带来的启发
以往在实验室里做CAR-T研发是相当不容易的，技术门槛和费用门槛都颇高，外包也存在耗费时间长，效果不稳定，使用时间窗口窄。从这个研究来看，如果能分析出S/MAR基序和无抗生素筛选等元件，自行构建载体从技术上难度不算大，特别是有各种无缝克隆试剂盒比如赛默飞的GeneArt™ Gibson Assembly® 克隆试剂盒系列加持（参看：怎样轻松快速地完成分子克隆？一文读懂秒变高手），要在DNA质粒载体上增减部分序列或者换个启动子都难不倒一般实验高手。德国美天旎磁珠分选有大中小型可以替换，MaxCyte电转设备可用Lonza的电转设备代替，门槛也不是特别高，在实验室实现CAR-T细胞制备看来是可行的——当制备CAR-T细胞不再是困扰研究人员的技术瓶颈时，他们将更加集中研究开发新的治疗靶点，为患者早日带来好消息。这样，以后是不是会有更多实验室进入研发CAR-T赛道，研究是不是会更加方便？拭目以待。