高等生物能够在环境因素刺激下，快速诱导特定基因的表达，保证了炎症反应、热休克应激等诸多细胞过程的发生。以组蛋白修饰和DNA甲基化为代表的表观机制是真核生物进化出来的重要转录调控策略。那么在刺激诱导型转录过程中，是否存在标志性表观修饰参与其中并发挥着关键调控作用呢？

2020年7月30日，清华大学李海涛课题组携手美国威尔康奈尔医学院Steven Josefowicz实验室、洛克菲勒大学C David Allis实验室等在《自然》（Nature）杂志正式发表题为“Histone H3.3 phosphorylation amplifies stimulation-induced transcription”（组蛋白H3.3磷酸化增强刺激诱导型转录） 的研究论文。研究团队利用内毒素诱导的巨噬细胞炎性反应模型，从生物化学、功能基因组学和结构生物学角度系统揭示了组蛋白变体H3.3第31位丝氨酸磷酸化（H3.3S31ph）在刺激诱导型快速转录延伸过程中标志性调控作用。

组蛋白H3.3是一类保守的“祖先级”组蛋白H3变体，是单细胞真核生物如酵母中的唯一组蛋白H3形式。与高等生物中复制依赖的组蛋白变体H3.1不同，组蛋白变体H3.3主要参与染色质动态活动调控，在转录、DNA损伤修复和有丝分裂等过程中发挥着重要作用。组蛋白变体H3.3 与“经典”的组蛋白H3.1或H3.2的一个重要区别在于其氨基端第31位残基为丝氨酸(Ser或S)， 而H3.1/2为丙氨酸(Ala或A)。这一氨基酸组成差异对于组蛋白H3.3的功能发挥有何意义是一个领域关注热点。

2014年，李海涛课题组与美国MD Anderson癌症中心的石晓冰教授实验室曾在Nature发表合作文章，首次发现抑癌因子ZMYND11是新型H3.3变体赖氨酸36三甲基化（H3.3K36me3）识别因子，并揭示其在抑制转录延伸过度活化方面的功能。在这一过程中，丝氨酸31因为其有别于丙氨酸31的氢键形成能力，贡献了ZMYND11对H3.3的特异识别。H3.3的第31位丝氨酸还可以被磷酸化，然而H3.3S31ph的功能与生物物理机制还需要进一步研究。

已知巨噬细胞被细菌脂多糖（LpS）刺激后，可以在数分钟至一个小时内，快速上调炎症相关基因的表达。在本工作中，作者发现在LpS刺激后，巨噬细胞中组蛋白H3.3的S31和S28位点磷酸化修饰水平显著上升，类似现象在其他细胞类型如DC细胞、NK细胞、B细胞和神经细胞等的刺激响应过程中保守存在。进一步对巨噬细胞进行RNA-seq和ChIp-seq分析，惊奇发现H3.3S31ph富集存在于LpS导基因的基因体（gene body）区，而H3S28ph则呈互补分布，主要存在于基因增强子、启动子、以及基因间区等区域。分别对ChIp-seq结果进行独立的peak calling和density rank order分析，作者发现H3.3S31ph修饰特异性地附着在刺激诱导表达型基因，而并非广谱性地结合持续表达型基因。

那么什么上游激酶催化了H3.3S31磷酸化修饰呢？作者根据ChIp-seq结果分析，发现很多刺激转录的基因都是NF-kB信号通路的靶基因，并且受已知的H3.3S31激酶CHK1的干扰较小，据此作者猜测产生H3.3S31ph修饰的激酶可能是NF-kB信号通路中的关键激酶IKKa。进一步研究发现，IKKa会在细胞受到刺激后定位到H3.3S31ph靶基因附近；加入IKKa特异抑制剂或对其进行小RNA干扰敲降，会导致靶基因周围H3.3S31ph水平的显著降低，表明IKKa是该过程中产生H3.3S31ph修饰的激酶。

同时，作者发现H3K36me3而非H3K36me2修饰在刺激诱导型基因上的定位与H3.3S31ph高度重合，且同步上调。在高等动物中，只有SETD2甲基转移酶能够完成H3K36位点的三甲基化， 而其他同源酶例如NSD2只能完成二甲基化。

李海涛课题组曾在2016年在Genes Dev发文首次解析出SETD2结合组蛋白底物的复合物结构。结构分析表明，发现H3S31位点位于一个正电荷富集区，这对于结合带有负电荷的H3.3S31ph修饰极为有利。通过体外酶活实验，作者发现H3.3S31的磷酸化修饰能够提高SETD2的甲基转移活力，对NSD2则没有促进作用。进一步的复合物结构解析证明H3.3S31ph的磷酸基团与SETD2的两个碱性残基K1600和K1673存在静电吸引和水介导的氢键作用，进而揭示了H3.3S31ph促进SETD2酶活的分子基础。有意思的是，序列分析表明K1600和K1673残基只在SETD2中存在且相当保守，而在NSD2等其他酶中则被替换为酸性或极性氨基酸，这也就完美解释了为什么H3.3S31ph不能促进与NSD2直接相关的组蛋白H3.3K36me2的修饰水平。

总之，生化与结构实验共同揭示出一种H3.3S31ph顺式激活H3.3K36me3酶促产生的组蛋白修饰交叉会话机制。

已知肿瘤抑制因子ZMYND11能够特异性地识别H3.3K36me3修饰，抑制转录延伸的过度活化。在本文中，作者通过结合结构分析、ITC滴定、以及ZMYND11的ChIp-seq分析，发现H3.3S31位点产生磷酸化后会因为体积排斥效应，“踢走”原本结合的ZMYND11，从而解除转录延伸共抑制子ZMYND11的抑制效应，促进了H3.3S31ph靶基因的活跃转录。本部分工作揭示出了一种H3.3S31ph对于H3.3K36me3修饰识别的二元开关（binary switch）调控机制。

总而言之，该研究对刺激诱导型基因的转录延伸机制从表观遗传层面进行了解析。刺激诱导产生的组蛋白H3.3S31ph修饰富集在基因体区，一方面促进了组蛋白H3.3K36me3修饰“书写器”（writer）SETD2的甲基转移酶活性，促进了转录延伸；另一方面拮抗了组蛋白H3.3K36me3修饰“阅读器”（reader）ZMYND11的结合，解除了其转录延伸共抑制。上述表观遗传机制使得细胞能够更好地响应与适应环境刺激，保证了刺激诱导型基因的快速表达。快速响应外界刺激并启动特定基因转录与多种细胞反应和疾病相关，本研究发现组蛋白H3.3S31磷酸化是开启特异性转录延伸激活的关键，为相关疾病治疗提供了新视角和新靶点。

李海涛与美国康奈尔医学院Steven Josefowicz助理教授是本论文的共同通讯作者。洛克菲勒大学C David Allis教授实验室博士后Anja Armache博士和李海涛课题组已毕业研究生杨爽博士为本论文共同第一作者，李海涛课题组岳媛博士参加本项工作。本项目得到了生命科学联合中心，国家自然科学基金委员会，科技部重大研究计划，北京结构生物学高精尖创新中心，北京生物结构前沿研究中心，以及上海同步辐射光源的支持。

原文标题：

Histone H3.3 phosphorylation amplifies stimulation-induced transcription

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2533-0