6月22日， Nature Methods杂志（影响因子28.467）在线发表了严健、张亮、陈居明教授带领的西北大学与香港城市大学联合研究团队的重要研究成果——CRISpR-Assisted Detection of RNA-protein Interactions in Living Cells，详细描述了CARpID技术细节。

团队经过一年多的努力，成功开发了一种检测活细胞内RNA与蛋白质相互作用的新技术，并取名为CARpID （全称CRISpR-Assisted RNA-protein Interaction Detection Method)，助力非编码RNA研究。

该技术具有广泛的应用前景，包括寻找在肿瘤发生过程中具有重要作用的RNA结合蛋白，以及用于发现新冠病毒RNA基因组侵入人体细胞后的重要结合蛋白，这些蛋白分子或许可以作为治疗相关疾病的药物靶点等。


什么是非编码RNA？

长链非编码核糖核酸（long non-coding RNAs，lncRNA）被认为是基因组中的主要“暗物质”。越来越多研究表明这些RNA分子可能参与细胞内一系列重要的生理活动，与肿瘤发生发展也有着密切关系。基因（DNA）突变引起肿瘤的发生。DNA突变一方面可能会改变相关蛋白质的序列和功能（突变造成了信使RNA序列的改变），另外一方面可能仅仅是改变了蛋白质在细胞内的数量。而蛋白质在细胞内的数量主要是受到基因转录水平影响，即中心法则中DNA到信使RNA这一步的活性。细胞的转录活性受到严格、精密、复杂的调控。

长非编码RNA在细胞中的位置、含量的多少、相互作用的蛋白质成分都可能直接影响它们发挥转录调控的作用。目前研究已经显示，长非编码RNA可以调节细胞的凋亡、肿瘤细胞的迁移以及肿瘤生长速度等等。例如，有证据显示，在肿瘤细胞中，想办法降低长非编码RNA MALAT1的量可让肿瘤细胞的黏附性增强，迁移性减弱，一定程度可以抑制恶性发生速度。

关于CARpID技术

要研究lncRNA在一些重要生理活动以及人类疾病发生过程中的机理，那么了解这些lncRNA的结合蛋白究竟是什么，这是其中的重要一步。

CARpID利用CRISpR/CasRx系统，将与之融合的BASU生物素转移酶特异牵引至活细胞中目标lncRNA附近，对邻近蛋白进行生物素化标记，以方便使用链霉素亲和偶联磁珠分离，然后对分离的蛋白质进行质谱的无标记定量对比分析，确认目标lncRNA的结合蛋白。

相较于以往的方法，CARpID的优势在于它不需要经过预先的小分子或者高能紫外线的交联，而是在生理条件下检测活细胞的lncRNA与蛋白质相互作用，可以有效避免交联所产生的系统性误差，例如一些非特异性结合的蛋白质可能会因为交联而被误判为某种lncRNA的结合蛋白质等。此外，由于其他方法几乎都需要设计多个RNA探针来富集目标lncRNA，对于细胞中含量比较低或者长度比较短的lncRNA技术难度较大。

而CARpID，仅仅需要30-80个核苷酸的识别区，且BASU可以在同一个蛋白质的多个位点上标记生物素，大大提高了方法的敏感性。

将CARpID方法应用于已被广泛研究的长非编码RNA XIST上，团队发现了很多之前未报道的XIST相互作用蛋白，包括转录起始因子TFIID亚基TAF15和ISWI染色质重塑因子SNF2L。随后的生化和功能验证确认了相互作用，并提出了X染色体失活调控的新机制。


如何推动肿瘤等疾病的治疗？

通过CARpID技术检测活检组织的长非编码RNA含量，如lncHIFCAR在口腔癌患者的肿瘤细胞中高表达，可作为临床上该疾病的检测标志物和治疗靶点；长非编码RNA LIpCAR在发生左心室重塑的患者中特异性表达，因而可作为心脏重塑的分子检测标志物；在胃癌患者中，长非编码RNA AA174084处于下调状态，因而可成为胃癌早期诊断的标志物；在结直肠癌患者体内，若lncRNA CCAT1和CCAT2高表达，则意味着该疾病生存率低和复发率高，所以也可作为临床检测标记物。

此外，在外泌体中也存在长非编码RNA，在肿瘤细胞中，外泌体长非编码RNA表达量升高，会促进肿瘤的发生，因此或可直接检测血液中某些长非编码RNA来作为临床检测标记物。

在活细胞内精准鉴定lncRNA的相互作用蛋白，可以帮助我们更好地揭示某些复杂人类疾病，如肿瘤、阿尔兹海默症、银屑病、脊髓小脑共济失调 8 型 (SCA8)等众多疾病的分子机制。

据悉，该技术研究的提出始于西北大学的严健教授，最初的实验设计、CARpID表达载体元件的构建、guide RNA的设计克隆，以及后期的基因组学分析都是由西北大学完成。香港城市大学主要在免疫沉淀、蛋白质组学分析、XIST相关的生物功能验证等方面做出贡献。

严健教授团队主要从事功能基因组学方向的研究，目前承担多项国家自然科学基金委面上项目和青年项目，与香港城市大学、瑞典卡罗琳斯卡医学院、德国癌症研究中心、美国杜克大学，以及空军军医大学合作密切。近年来，严健教授团队在转录调控方向的研究取得了突破，在Cell、Nature Methods、Nucleic Acids Research等国际权威期刊发表论文多篇。

来源：西北大学